通過秀麗線蟲研究線粒體應激對ROS產(chǎn)生及衰老的影響.pdf

1、線粒體是細胞ATP產(chǎn)生，三羧酸循環(huán)，脂類、鐵硫簇、血紅素合成的主要場所，同時也是細胞內(nèi)ROS的主要來源。線粒體功能與細胞的生存與代謝密切相關，線粒體參與了自噬，凋亡，細胞分裂，信號傳遞等幾乎所有的生化過程。線粒體功能的紊亂可以導致許多疾病的發(fā)生，如費氏共濟失調(diào)、阿爾茨海默癥、帕金森病、糖尿病、Leber視神經(jīng)病等。線粒體作為ROS的主要來源，也被認為與衰老的發(fā)生有關。衰老的自由基假說認為自由基可以對細胞內(nèi)大分子如蛋白質(zhì)、脂類、DNA造成

2、損傷，引起細胞功能紊亂，最終導致衰老。清除自由基的超氧化物歧化酶的發(fā)現(xiàn)說明細胞有專門應對ROS的機制，是這一假說的重要證據(jù)。不過，這一假說目前還是存在爭議。
　　本研究采用線蟲為模型，發(fā)現(xiàn)PQ對線蟲的ROS影響是復雜的。只給予30分鐘的短暫刺激，線蟲的ROS確實是增加的，這與文獻報道“PQ可以誘導產(chǎn)生ROS”的結(jié)論是一致的。但是，從卵開始孵化就生活在PQ環(huán)境中的線蟲，無論是活體染色還是裂解后測定，或者提取線粒體后測定，ROS及超氧

3、離子相對未經(jīng)PQ處理組都是降低的。通過陽性對照的實驗，即紫外照射及熱激后測定線蟲ROS及超氧離子發(fā)現(xiàn)是上升的，證明了我們測定方法的可靠性。我推測在慢性PQ處理下，一些保護性的機制會激活，從而有助線蟲適應不利的環(huán)境，增加對氧化應激的抵抗力，進而引起ROS及超氧離子的降低。通過測定發(fā)現(xiàn)慢性PQ處理下sod-3， gst-4，hsp-6等清除自由基或者維持細胞蛋白穩(wěn)態(tài)的基因的表達是上調(diào)的。PQ慢性處理過的線蟲對高滲透壓，高溫，以及高強度氧化應

4、激的抵抗力明顯強于未經(jīng)PQ處理過的線蟲。進一步的研究發(fā)現(xiàn)sod-2， sod-3及daf-16與ROS的減少密切相關，當這些基因突變時，PQ慢性處理后ROS不僅不會降低而且相對未處理組還會升高。自由基衰老理論認為自由基對蛋白質(zhì)，脂類，DNA等大分子的損傷作用導致了細胞功能紊亂與衰老的發(fā)生。然而，最近有一些文獻報道適當濃度的PQ慢性處理可以延長線蟲的壽命。本人也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，本研究采用了PQ濃度從低到高的七個處理，即0，0.03，0.0

5、5，0.1，0.2，0.3，0.5mM PQ處理組。發(fā)現(xiàn)在0.3mM PQ慢性處理下線蟲的壽命是明顯延長的，這與文獻報道適當?shù)陌俨菘萏幚砜梢匝娱L壽命的結(jié)論也是一致的。然而，此前的報道籠統(tǒng)的把“壽命”延長混淆于線蟲的“衰老”延緩。本人在研究中發(fā)現(xiàn)，0.3mM PQ雖然延長了壽命約兩天，但是卻使得從卵到生長停止的時間“膨脹”了四天。我們很難說從卵開始線蟲就步入了“衰老”過程。如果從停止生長開始算衰老起點的話，0.3mM PQ反而是加速衰老的

6、。如果把推遲發(fā)育這一因素考慮進去，0.1mM以上的PQ處理都是促進衰老的。0.03，0.05mM PQ由于濃度太低，沒有對壽命造成明顯的影響。本文進一步提供了其他證據(jù)證明PQ慢性處理可以促進衰老，即等線蟲停止發(fā)育后再對其進行PQ處理，發(fā)現(xiàn)隨著PQ濃度的增加壽命有越來越短的趨勢。而且無論從卵還是從成蟲開始對線蟲進行PQ慢性處理都加速了衰老伴隨的運動能力的下降。這些實驗證實了PQ慢性處理加速了衰老。通過實驗發(fā)現(xiàn)線粒體mtDNA拷貝數(shù)及ATP

7、合成并未降低。因此， ROS的降低不是由于線粒體數(shù)量的減少及功能紊亂造成的，而是由于清除ROS能力的增強。PQ慢性處理后ROS雖然降低了，但是線蟲卻衰老的加快了。然而，線粒體呼吸鏈亞基編碼基因nuo-6的RNA干擾也降低了ROS，但其壽命卻是明顯延長的，衰老也是延緩的，綜合這兩種情況提示ROS不能直接導致衰老的加快或延緩。PQ對于細胞或線蟲來說是一種不利的外界因素，它可以導致線粒體功能紊亂及穩(wěn)態(tài)的失衡。編碼線粒體蛋白的基因突變對線蟲是一

8、種不利的內(nèi)部因素，它也會影響線蟲的正常代謝活動及破壞線粒體穩(wěn)態(tài)。當這些編碼線粒體的重要蛋白的基因突變或?qū)ζ溥M行RNAi處理時，線蟲體內(nèi)會激活一系列的保護性機制，包括未折疊蛋白反應（即UPRmt），GCN-2介導的蛋白翻譯途徑，HIF-1介導的低氧應答機制等，這同PQ處理的情況類似，后者也激活UPRmt，GCN-2通路等。然而，基因突變或干擾造成的線粒體功能紊亂很多時候可以延長壽命，UPRmt，GCN-2，HIF-1等通路被認為與壽命延長

9、有關。本研究發(fā)現(xiàn)這些保護性機制的激活只是一種對不利內(nèi)部環(huán)境的反饋性的應答，增加了線蟲對不良環(huán)境的適應能力，這些保護性的機制本身不是壽命延長的原因。如UPRmt的激活不能延長壽命，它的阻斷對呼吸鏈亞基nuo-6， cco-1 RNAi介導的壽命延長沒有影響。同樣的，GCN-2及HIF-1的缺失也對壽命延長沒有影響。UPRmt等保護性機制雖然在PQ慢性處理下都是激活的，但線蟲卻是加速衰老的，同樣暗示了保護性機制不是導致壽命延長的原因。隨著衰