IUGR仔豬腸道黏膜免疫特性及丁酸衍生物對(duì)其調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、子宮內(nèi)發(fā)育遲緩在人和豬上都很常見(jiàn)，全球每年出生的嬰兒中約有1300萬(wàn)為IUGR，在中國(guó)，平均每一窩仔豬出生就有1-3頭為IUGR仔豬，發(fā)病率約為15％-20％。IUGR會(huì)導(dǎo)致新生仔豬或新生胎兒較高的發(fā)病率和死亡率，甚至最終導(dǎo)致其長(zhǎng)期的發(fā)育受損。IUGR給養(yǎng)豬生產(chǎn)和人類健康都帶來(lái)了很大影響。如何從營(yíng)養(yǎng)學(xué)的角度對(duì)母豬和IUGR仔豬進(jìn)行調(diào)控，已經(jīng)引進(jìn)廣泛關(guān)注。IUGR給養(yǎng)豬生產(chǎn)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損失的主要原因有兩個(gè):1、IUGR新生仔豬較高的發(fā)病率和死

2、亡率;2、存活下來(lái)的IUGR仔豬也會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)性能下降、飼料利用率下降和瘦肉率下降等情況。為了更好地制定IUGR仔豬的日糧，減少I(mǎi)UGR帶來(lái)的損失，了解IUGR仔豬的生理及其作用機(jī)理具有很重要的意義。研究IUGR仔豬及其營(yíng)養(yǎng)調(diào)控，不僅可以解決養(yǎng)豬生產(chǎn)中的IUGR問(wèn)題，而且可以作為一種很好的醫(yī)學(xué)模型。本試驗(yàn)以IUGR仔豬為研究對(duì)象，研究了IUGR新生仔豬腸道黏膜免疫特性并探討其分子作用機(jī)制;研究了三丁酸甘油酯對(duì)哺乳期IUGR仔豬生長(zhǎng)和腸道黏

3、膜免疫的調(diào)節(jié)作用;并比較研究了丁酸鈉和三丁酸甘油酯對(duì)IUGR斷奶仔豬生長(zhǎng)和腸道黏膜免疫的調(diào)節(jié)作用。
　　1.IUGR新生仔豬腸道黏膜免疫特性
　　試驗(yàn)一選取NBW和IUGR新生仔豬各6頭，所有仔豬不喂食初乳，在出生后2-4小時(shí)內(nèi)屠宰取樣。測(cè)定體重、免疫器官重、小腸重量和長(zhǎng)度、腸道形態(tài)、腸道上皮免疫細(xì)胞數(shù)量、腸道黏膜中細(xì)胞因子和免疫球蛋白含量、腸道黏膜中細(xì)胞因子的基因表達(dá)。結(jié)果表明，(1) IUGR組仔豬的胸腺、脾臟、腸系膜淋

4、巴結(jié)和腸道的絕對(duì)重量降低（P＜0.01），腸道絕對(duì)長(zhǎng)度減小(P＜0.05)。IUGR新生仔豬的胸腺、脾臟和腸腺膜淋巴結(jié)的相對(duì)重量以及單位長(zhǎng)度腸道重量顯著低于（P＜0.01）NBW仔豬。但I(xiàn)UGR仔豬的相對(duì)小腸長(zhǎng)度增加（P＜0.01）。(2)IUGR新生仔豬小腸腸道絨毛更易受損、更短、長(zhǎng)短不一，而NBW仔豬小腸腸道絨毛多完整且整齊。IUGR新生仔豬小腸微絨毛比NBW仔豬的更短且更少。此外，在一些IUGR仔豬的腸道中還觀察到自噬體和線粒體腫

5、脹，而這些現(xiàn)象在NBW仔豬腸道中未找見(jiàn)。(3)IUGR新生仔豬小腸絨毛高度、絨毛高度與隱窩深度的比值和絨毛表面積降低（P＜0.01），隱窩深度增加（P＜0.05）。IUGR仔豬回腸絨毛高度降低(P＜0.05)，空腸和回腸絨毛表面積減小(P＜0.05)，回腸絨毛隱窩深度（P＜0.01）和絨毛高度與隱窩深度的比值（P＜0.01）增加。(4) IUGR仔豬空腸（P＜0.05）和回腸（P＜0.01）上皮中杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著降低。IUGR新生仔豬回

6、腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著低于(P＜0.05)NBW仔豬。(5)IUGR新生仔豬小腸黏膜IFN-γ（P＜0.05）含量顯著低于NBW組。IUGR新生仔豬回腸TNF-α的分泌量顯著低于（P＜0.01）NBW仔豬。(6)IUGR新生仔豬空腸IFN-γ基因表達(dá)量低于(P＜0.05)NBW組。IUGR新生仔豬回腸黏膜內(nèi)的IL1β（P＜0.05）、IL2(P＜0.01)、IL10（P＜0.01）和TNF-α（P＜0.01）的基因表達(dá)量都顯著低于NB

7、W組。總之，IUGR新生仔豬小腸黏膜免疫受損，其腸道和腸系膜淋巴結(jié)發(fā)育不良，腸黏膜機(jī)械屏障受損，腸黏膜上皮內(nèi)的免疫細(xì)胞數(shù)量減少（包括杯狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞），腸道黏膜分泌細(xì)胞因子的能力下降，并且回腸是主要的損傷部位。
　　2.IUGR新生仔豬腸道CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量和分布
　　試驗(yàn)設(shè)計(jì)同試驗(yàn)一。測(cè)定NBW和IUGR新生仔豬血清中中免疫球蛋白和細(xì)胞因子水平，血液和脾臟中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，胸腺、腸系膜淋

8、巴結(jié)、空腸和回腸中CD4和CD8蛋白及基因表達(dá)，回腸黏膜中CD4和CD8蛋白的分布，空腸和回腸中MHC-Ⅱ基因表達(dá)及回腸中MHC-Ⅱ蛋白分布。結(jié)果表明，與NBW新生仔豬相比，(1) IUGR新生仔豬血清中IL1β（P＜0.05）、IL2(P＜0.05)、IL4（P=0.085）、IL10(P＜0.05)和TNF-α（P=0.096）的含量降低或有降低的趨勢(shì)。(2)IUGR新生仔豬血液和脾臟中CD8+T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著升高（P＜0.05

9、），CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞的比值降低（P＜0.05）。(3)新生仔豬CD4在胸腺中含量最高、腸系膜淋巴結(jié)中稍低、在腸道組織中更低(P＜0.05)。IUGR仔豬胸腺中CD8蛋白的表達(dá)量高于（P＜0.05）NBW仔豬，但腸系膜淋巴結(jié)中CD8蛋白的表達(dá)量低于（P＜0.05）NBW仔豬。(4) IUGR新生仔豬胸腺中的CD4基因表達(dá)量顯著高于（P＜0.05）NBW仔豬。IUGR新生仔豬空腸和回腸的CD4和CD8基因的表達(dá)量都顯著低于（P

10、＜0.01）NBW。(5) CD4蛋白主要在NBW和IUGR新生仔豬回腸黏膜的絨毛固有層表達(dá)，CD8在回腸絨毛的上皮細(xì)胞和固有層中均有表達(dá)。CD4主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，而CD8在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)。(6) IUGR新生仔豬空腸和回腸中MHC-Ⅱ基因的表達(dá)量都顯著低于(P＜0.01)NBW新生仔豬。MHC-Ⅱ在NBW仔豬回腸絨毛的固有層大片地表達(dá)，但在IUGR的絨毛固有層只是點(diǎn)狀少量表達(dá)?？傊琁UGR新生仔豬腸道黏膜免疫受損與其體內(nèi)

11、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量和分布不平衡、腸道抗原遞呈功能減弱有關(guān)。
　　3.IUGR新生仔豬腸道m(xù)iRNA和Notch2/Jagged1信號(hào)通路關(guān)鍵因子的表述
　　試驗(yàn)設(shè)計(jì)同試驗(yàn)一。測(cè)定NBW和IUGR新生仔豬胸腺、腸系膜淋巴結(jié)、空腸和回腸中Notch信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)，空腸和回腸Notch信號(hào)通路和TLR信號(hào)通路關(guān)鍵基因的表達(dá)，小腸miRNA的表達(dá)，回腸miRNA的表達(dá)，回腸Jagged1蛋白的表達(dá)，豬的J

12、agged1基因與miRNA靶向作用的PITA評(píng)分。結(jié)果表明，與NBW組相比，(1) IUGR組胸腺Delta1基因表達(dá)量下降（P＜0.05），空腸中Delta1和Hes1基因基因、空腸和回腸中Jagged1基因表達(dá)量升高(P＜0.05)。(2)IUGR仔豬腸道內(nèi)21種miRNA上調(diào)，22種miRNA下調(diào)。qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果基本一致。IUGR新生仔豬腸道中miR-19a-3p（P＜0.01）、miR-17-5p（P＜0.0

13、5）、miR-199a-5p（P=0.051）、miR-15a(P=0.076)、miR-19a（P＜0.01）和ssc-miR-19b(P＜0.01)都上調(diào)或有上調(diào)趨勢(shì);而miR320(P＜0.01)、miR-181b(P＜0.05)、ssc-miR-151-3p(P=0.050)、ssc-miR-128（P=0.069）和miR-15b（P=0.087）均下調(diào)或有下調(diào)趨勢(shì)。(3)IUGR新生仔豬回腸中的miR-19a-3p有上升的趨

14、勢(shì)（P=0.071）、miR-19b顯著上升(P＜0.05)、miR-181b顯著下降(P＜0.05)。(4)IUGR新生仔豬回腸中Jagged1蛋白的表達(dá)顯著高于(P＜0.05)NBW組。(5)miR-320與Jagged1基因可能存在靶向作用?？傊?，IUGR新生仔豬體內(nèi)CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量和分布不平衡可能與Notch信號(hào)通路有關(guān)，且IUGR新生仔豬腸道黏膜免疫功能受損可能與miRNA參與調(diào)節(jié)Notch2/Jagged

15、1等信號(hào)通路關(guān)鍵因子的表達(dá)有關(guān)。
　　4.三丁酸甘油酯對(duì)IUGR哺乳仔豬腸道黏膜免疫的調(diào)節(jié)作用
　　試驗(yàn)選取8頭NBW和16頭IUGR新生仔豬，NBW仔豬為NBW組，IUGR仔豬分為IUGR組和IT組，每組8頭仔豬。所有仔豬自然哺乳至7日齡斷奶。7日齡至21日齡，NBW組和IUGR組飼喂基礎(chǔ)奶粉日糧，IT組飼喂添加了0.1％三丁酸甘油酯的奶粉日糧。21日齡每組選6頭仔豬屠宰取樣。測(cè)定所有仔豬在0d、7d、10d、14d、17

16、d和20d的體重，測(cè)定腸道消化酶活性、腸道絨毛形態(tài)、腸道黏膜免疫球蛋白水平、腸道IgG、FcRn和GPR41基因水平。結(jié)果表明，(1)IUGR和IT組仔豬的體重在0d、7d、1id和14d的時(shí)候都顯著低于（P＜0.05）NBW組，但是在17d和20d時(shí)，IT組仔豬的體重顯著高于IUGR組(P＜0.05)，且與NBW組差異不顯著（P＞0.05）。(2) IUGR組仔豬的脾臟重顯著低于(P＜0.05) NBW組，而IT組的脾臟重和相對(duì)脾臟重

17、顯著高于(P＜0.05)IUGR組。與NBW組相比，IUGR組仔豬的空腸更薄(P＜0.05)，十二指腸相對(duì)長(zhǎng)度增加(P＜0.05)，IT組的空腸相對(duì)長(zhǎng)度低于（P＜0.05）IUGR組，(3) IUGR組仔豬小腸絨毛長(zhǎng)短不一， IT和NBW組仔豬小腸絨毛比較整齊。IUGR組仔豬小腸絨毛呈扁平狀，更易受損，而IT和NBW組的小腸絨毛較完整且發(fā)育良好。(4) NBW組的絨毛長(zhǎng)度最高，IT組次之，IUGR組最短;IT組的肌層厚度和黏膜厚度最高，

18、NBW組次之，IUGR組最低。此外，三組仔豬十二指腸和空腸絨毛形態(tài)差異顯著。(5)在十二指腸，IUGR組仔豬乳糖酶、蔗糖酶和脂肪酶活性低于(P＜0.05)NBW組，麥芽糖酶活性高于(P＜0.05) NBW組，而IT組仔豬乳糖酶活性顯著高于(P＜0.05) IUGR組。在空腸，與NBW組仔豬相比，IUGR組仔豬胰蛋白酶活性降低（P＜0.05），蔗糖酶活性升高（P＜0.05）;而IT組仔豬胰蛋白酶活性高于(P＜0.05) IUGR組，蔗糖酶

19、活性低于（P＜0.05）IUGR組。在回腸，IUGR仔豬5種消化酶活性均低于（P＜0.05）NBW組，IT組仔豬回腸這5種消化酶活性均高于(P＜0.05)IUGR組(6) IUGR仔豬回腸黏膜sIgA和IgG抗體的含量低于(P＜0.05) NBW組，而IT組仔豬回腸黏膜sIgA和IgG抗體的含量顯著高于（P＜0.05）IUGR組。(7)IUGR仔豬十二指腸、空腸和回腸中IgG基因的表達(dá)量都低于（P＜0.05）NBW組，而IT組仔豬回腸中

20、IgG的含量顯著高于（P＜0.05）IUGR組。IUGR組仔豬十二指腸和回腸中GPR41基因表達(dá)量低于（P＜0.05）NBW組，而IT組仔豬十二指腸和回腸中GPR41基因表達(dá)量顯著高于(P＜0.05)IUGR組?？傊?，三丁酸甘油酯可以提高IUGR哺乳仔豬的日增重、促進(jìn)其腸道和免疫器官發(fā)育、改善腸道絨毛形態(tài)、提高腸道絨毛表面積和腸道內(nèi)消化酶活性、提高腸道黏膜內(nèi)抗體水平并促進(jìn)IgG和GPR41基因的表達(dá)。
　　5.丁酸鈉和三丁酸甘油酯

21、對(duì)IUGR斷奶仔豬腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)作用的比較
　　試驗(yàn)選取8頭NBW新生仔豬和24頭IUGR新生仔豬。NBW仔豬為NBW組，來(lái)自與同一窩的3頭IUGR仔豬被分別分到IUGR組、IS組（IUGR+0.05％丁酸鈉）和IT組（IUGR+0.09％三丁酸甘油酯）。所有仔豬0到21d齡自然哺乳，21d齡斷奶，NBW組和IUGR組飼喂基礎(chǔ)日糧，IS飼喂丁酸鈉日糧（基礎(chǔ)日糧+0.05％丁酸鈉），IT組飼喂三丁酸甘油酯日糧（基礎(chǔ)日糧+0.09％

22、三丁酸甘油酯），直至35d試驗(yàn)結(jié)束。測(cè)定所有仔豬在0d、21d、24d、27d、31d和35d的空腹體重、試驗(yàn)期仔豬腹瀉率，計(jì)算每組每只仔豬平均日采食量、平均日增重和飼料利用率。每組選6頭仔豬屠宰取樣。測(cè)定仔豬免疫器官重、腸道長(zhǎng)度和重量、腸道絨毛形態(tài)、腸道消化酶活性、腸道黏膜中免疫相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果表明，(1) IUGR、IS和IT組仔豬體重0d、21d、24d和27d時(shí)都顯著低于(P＜0.05) NBW組，但31d和34d時(shí)，IS組

23、和IT組仔豬的體重與NBW組差異不顯著（P＞0.05）。(2)IUGR組仔豬十二指腸重顯著低于（P＜0.05）NBW組，相對(duì)空腸長(zhǎng)度顯著高于（P＜0.05）NBW組，IS組十二指腸重和相對(duì)空腸重均顯著高于（P＜0.05）IUGR組，IT組的相對(duì)十二指腸重顯著低于(P＜0.05)IS組。(3)IUGR組仔豬小腸絨毛形態(tài)指標(biāo)均不如NBW組，飼喂丁酸鈉或三丁酸甘油酯后，小腸絨毛形態(tài)有不同程度的改善。(4)總體趨勢(shì)是，IUGR仔豬小腸消化酶活性

24、低于NBW組，飼喂丁酸鈉或三丁酸甘油酯后，消化酶活性有不同程度的提高。(5)IUGR組小腸黏膜一些部位CD4、CD8、FcRn、GPR41和IgG基因表達(dá)低于NBW組。IS組小腸黏膜一些部位CD4、CD8、MHC-Ⅱ、FcRn和IgG基因表達(dá)高于IUGR組，IT組小腸黏膜一些部位MHC-Ⅱ、FcRn、IgG和GPR41基因表達(dá)均高于(P＜0.05) IUGR組，IT組空腸和回腸CD4基因表達(dá)低于(P＜0.05)IS組，十二指腸IgG基因

25、表達(dá)高于（P＜0.05）IS組，空腸IgG基因和十二指腸GPR41基因高于（P＜0.05）IS組?？傊?，在斷奶時(shí)，給IUGR仔豬補(bǔ)飼丁酸鈉或三丁酸甘油酯均可以從一定程度上提高其生長(zhǎng)性能和增強(qiáng)其腸道黏膜免疫功能，且丁酸鈉效果略優(yōu)于三丁酸甘油酯。
　　總之，通過(guò)以上五部分試驗(yàn)內(nèi)容，我們研究了IUGR新生仔豬腸道黏膜免疫的特性，發(fā)現(xiàn)其腸道黏膜免疫受損，腸道黏膜細(xì)胞因子分泌功能減弱;我們懷疑這與其腸黏膜內(nèi)免疫細(xì)胞數(shù)量的減少，尤其是T淋巴細(xì)

26、胞數(shù)量的減少有關(guān)，于是，進(jìn)一步研究了IUGR新生仔豬體內(nèi)中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和分布，發(fā)現(xiàn)IUGR新生仔豬體內(nèi)T淋巴細(xì)胞亞群失衡，腸黏膜抗原遞呈功能受損;于是，我們進(jìn)一步探討了其分子機(jī)制，研究了IUGR新生仔豬腸道內(nèi)miRNA和Notch2/Jagged1信號(hào)通路關(guān)鍵因子的表達(dá)，篩選出了NBW和IUGR仔豬小腸中差異表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)IUGR新生仔豬腸道黏膜免疫功能受損可能與miRNA參與調(diào)節(jié)Notch2/Jagged