犬埃立克體(Ehrlichia canis)分離鑒定、基因組學及動物感染模型的建立.pdf

1、埃立克體是Anaplasmataceae科中的一類嚴格胞內寄生、以蜱蟲為主要傳播媒介的革蘭氏陰性微生物，其具有廣泛的感染宿主譜。根據(jù)16S rRNA基因和其他相關基因的序列，目前Ehrlichia屬包括5個種:Ehrlichia canis、E.chaffeensis、E.ruminantium、E.ewingii、E.muris。其中E chaffeensis主要在人群中流行，并引起人單核細胞埃立克體病(human monocytic

2、 ehrlichiosis，HME);E.rummantium主要感染反芻動物，如牛、綿羊、山羊等，給相關的養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失;而E.canis是一種主要感染犬科動物導致犬單核細胞埃立克體病（canine monocytic ehrlichiosis，CME）的人獸共患傳染性病原體。E.canis感染犬之后主要表現(xiàn)為發(fā)熱、精神沉郁、厭食、眼鼻分泌物增多等臨床癥狀，并可分為急性感染期、亞臨床癥狀期、慢性感染期三個階段。
　　

3、作為一種重要的人獸共患傳染性病原體，E.canis主要感染犬科動物尤其是伴侶動物給人類健康帶來了巨大的威脅。本研究通過建立一種可以同時檢測所有埃立克體的FRET-qPCR方法并將其應用于中國的伴侶動物和反芻動物樣品中，從而調查中國埃立克體病的流行現(xiàn)狀;并通過犬巨噬細胞系，在體外培養(yǎng)獲得E.canis YZ1菌株;同時，對其與細胞自噬的關系做了初步探索;進一步對其全基因組序列進行測定和分析;通過實驗比格犬模型，對此分離株的致病性、治療等進

4、行了系統(tǒng)地研究。
　　一、檢測所有埃立克體種的FRET-qPCR方法的建立
　　目前，埃立克體屬得到認可的種主要有5個，但同時隨著檢測技術和分子生物學技術的不斷發(fā)展越來越多的對養(yǎng)殖業(yè)、人和動物健康具有巨大威脅的菌株被發(fā)現(xiàn)，如Panola Montain Ehrlichia(PME)等。但現(xiàn)在的血清學檢測方法在埃立克體屬內部甚至Anaplasmataceae科內部存在交叉反應，而目前已有的PCR檢測方法只能檢測單個或部分埃立克

5、體種或者無法區(qū)分與埃立克體同源性相近的其他蟲媒病原體。本研究根據(jù)16SrRNA基因中保守區(qū)間設計了一對引物和一對探針，建立了一種可以在單個反應孔中同時檢測并分型所有常見埃立克體種的FRET-qPCR方法，并可以通過高分辨率熔解曲線分析中Tm值的不同將所有埃立克體分為4個組:E.rummantium(Tm～55.8℃)，E.chaffeensis和E ewingii(Tm～57.7℃),E.canis、E.muris、E.ovina和Eh

6、rlichia sp.BOV2010(Tm～62.0℃)，the Panola Mountain Ehrlichia(Tm～65.5℃);且此檢測方法具有極高的靈敏度，可以在每個反應孔中最低檢測到單個拷貝的病原體核酸。本研究更進一步通過將此靈敏特異的FRET-qPCR應用于5個加勒比海島的反芻動物樣品中埃立克體病流行現(xiàn)狀的調查之中進一步驗證了此方法的可行性，且結果表明其中有12.2％(134/1,101)的動物感染了埃立克體病原體，其中

7、包括牛76份(19.7％，76/385)，綿羊45份(13.2％，45/340)、山羊13份(3.5％，13/376);進一步通過巢式PCR和基因測序發(fā)現(xiàn)所有感染的埃立克體為E.canis或者與其同源性及其相近的埃立克體菌株。
　　二、中國伴侶動物和反芻動物埃立克體病的分子流行學調查
　　中國具有悠久的寵物飼養(yǎng)和野生動物馴化為家畜飼養(yǎng)的歷史，近年來隨著中國經(jīng)濟的飛速發(fā)展，畜牧養(yǎng)殖業(yè)得到了長足發(fā)展，家畜存欄量位居世界前列;同時

8、隨著居民生活水平的不斷提高，寵物數(shù)量也在逐年增加。與此同時，家畜和伴侶動物中傳染病尤其是人畜共患傳染病數(shù)量也在不斷增加，給人類食品安全和生命健康帶來了巨大威脅，尤其是其中的蟲媒疾病等慢性傳染病，大大降低了家畜的經(jīng)濟價值。為了進一步了解埃立克體病在中國伴侶動物和反芻動物中的流行現(xiàn)狀，通過分子生物學方法對來自中國10個省份12城市的1，114份犬血液樣品及其體表寄生蟲（146份蜱蟲、37份虱子）和12省份的2，240份反芻動物樣品中埃立克體

9、病的流行現(xiàn)狀進行了調查。結果顯示，有15份犬血液樣品(1.3％，15/1，114)、6份蜱蟲樣品(4.1％，6/146)中具有埃立克體的核酸，且通過進一步確定其為E.canis;同時，2份綿羊樣品(0.8％，2/111)、3份山羊樣品(1.1％，3/270)、65份牛樣品(3.6％，65/1，830)、0份水牛樣品(0/29)表現(xiàn)為埃立克體核酸陽性，進一步通過gltA基因確定，感染的埃立克體為E.canis或與其及其相近的埃立克體菌株。

10、
　　三、Ehrlichia canis的體外分離培養(yǎng)
　　Ehrlichia canis是一種嚴格胞內寄生的革蘭氏陰性微生物，其脫離宿主細胞后2-3小時即會死亡。該病原體首次于1935年的阿爾及利亞被發(fā)現(xiàn)，中國于1999年在軍用犬中首次報道。E.canis最初通過培養(yǎng)陽性感染犬的單核細胞來保存病原體，隨后通過陽性感染的單核細胞接種于未感染的細胞獲得持續(xù)培養(yǎng)，并最后通過DH82犬巨噬細胞系獲得持續(xù)傳代培養(yǎng)，隨后又在人-犬雜交

11、細胞系、人微血管細胞、BALB/C小鼠巨噬細胞，以及蜱蟲細胞系IDE8、ISE6、IRE/CTVM18中獲得了體外培養(yǎng)。中國也通過保存陽性感染犬的淋巴細胞保存了E.canis病原體，但目前為止還沒有體外傳代培養(yǎng)的報道。本研究通過DH82犬巨噬細胞從陽性感染犬的淋巴細胞中成功在體外培養(yǎng)了E.canis病原體，并獲得了持續(xù)傳代培養(yǎng);同時，成功在Vero非洲綠猴腎細胞中獲得持續(xù)培養(yǎng)。通過吉姆薩染色，本研究觀察研究了E.canis在感染DH82

12、細胞和Vero細胞后的第1、2、3天不同時期時細胞內的形態(tài)特征，并成功觀察到其在感染細胞內形成的內涵體(morula)形態(tài)特征。
　　四、Ehrlichia canis YZ1菌株全基因組測序及比較基因組學分析
　　本研究通過第三代測序技術，對中國首次分離獲得的E.canis YZ1株病原體進行了全基因組測序及分析，并在世界范圍內獲得了第二個E.canis的全基因組序列。獲得E.canis YZ1菌株的基因組總長度為1，31

13、4，789bp，其中編碼基因長度為956，238bp，共編碼1，022個基因，基因組中％GC為29.0％;其中有65個散在重復序列和158個串聯(lián)重復序列;同時預測到一個長度為44，886bp的基因島。通過與rRNA庫比對后共找到36個tRNA可以轉運20種氨基酸，1個5S rRNA，1個16S rRNA和1個23S rRNA。通過對所有基因進行功能分析，共獲得GO功能注釋結果2，959個，其主要集中在細胞過程和新陳代謝過程;其中537個

14、基因與KEGG代謝通路有關，而且74個與翻譯生物過程有關;其中757個基因的氨基酸序列與COG生物功能有關，且135個與翻譯、核糖體組成和生物合成有關。通過與其他6株埃立克體菌株（E.canis strain Jake，E.ruminantium，E.muris，E.chaffeensis，E.mineirensis，Ehrlichia sp.）進行共線性分析，其中只有E.canis Jake菌株參考基因組中99.3％的部分與E.can

15、is YZ1菌株基因組中的99.3％的序列參與了線性化比對，而其他5個參考序列參與比對時E.canis YZ1菌株參與部分低于80％、參考序列低于90％，共線性較差。將E.canis YZ1菌株與參考序列進行全局比對，與E.canis參考序列相比具有最少的（1，748個）在基因水平上由單個核苷酸變異引起的潛在的DNA序列多態(tài)性SNP位點;E.canis YZ1菌株基因組CDS內部存在多個插入和缺失突變類型。同時，E.canis YZ1菌

16、株的起始段和末尾段與E.canis strain Jake參考基因組序列相比存在倒置和易位突變。
　　五、細胞自噬在Ehrlichia canis感染中作用機制的初步研究
　　Ehrlichia canis是一種嚴格胞內寄生、主要感染犬科動物的蜱傳病原體，主要引起犬單核細胞埃立克體病。雖然E.canis的宿主譜很廣，其中也有感染人的報道，但是截至目前還沒有自噬在E.canis感染宿主細胞時作用方式的相關研究。本研究通過聚丙烯

17、酰胺凝膠電泳、蛋白印記、免疫熒光等多種方法對E.canis感染DH82細胞和Vero細胞時自噬相關蛋白的變化情況進行了研究。結果顯示，E.cams感染的犬巨噬細胞和猴腎細胞中LC3蛋白表達量上升、p62蛋白表達量少量下降;GFP-LC3標記的質粒轉染進入細胞后出現(xiàn)了點狀聚集且集中于病原體周圍，且LC3雙熒光慢病毒感染細胞后出現(xiàn)了紅色和綠色熒光的疊加，且綠色熒光未發(fā)生明顯的降解;同時，RAB5也在包被病原體的膜結構表面形成點狀聚集;通過自

18、噬抑制劑bafilomycin、3-MA和自噬促進劑rapamycin處理E.canis感染的細胞并分別作用于溶酶體、PI3K和mTOR后，病原體的增殖速率均得到了提升。由此說明，自噬相關蛋白LC3、p62、RAB5、PI3K等均參與了E.canis感染宿主細胞的過程;同時，病原體E.canis可以利用宿主細胞自噬過程獲得營養(yǎng)物質進行擴增繁殖;而且，E.canis感染后形成內涵體后不會與溶酶體結合，從而可以逃避宿主細胞的對外來物質的清除