豬偽狂犬病病毒gB蛋白B細(xì)胞表位解析及其阻斷ELISA抗體檢測方法的建立.pdf

1、偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是一種由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的豬、牛、羊等多種哺乳動物的重要傳染病，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，疫苗免疫成為防控偽狂犬病的主要手段。但是，2011年以來，我國許多規(guī)模化豬場再次出現(xiàn)PRV大流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。本研究從我國發(fā)病豬場分離得到1株P(guān)RV強(qiáng)毒株，采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)獲得的PRV超強(qiáng)毒株2J01gB和gE重組蛋白，制

2、備獲得4株抗PRV單克隆抗體，闡明了gB蛋白一個(gè)抗原表位，采用重組gB蛋白和辣根過氧化物酶標(biāo)記的gB蛋白單抗，成功建立了檢測PRV抗體的阻斷ELISA方法，為該病防控奠定了重要基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容包括:
　　1.江蘇省豬偽狂犬病病毒強(qiáng)毒株分離與致病性研究
　　從臨床發(fā)病豬群分離獲得一株P(guān)RVNJ毒株，gC和gD基因推導(dǎo)的氨基酸序列與先前報(bào)道的毒株相比分別有7個(gè)與2個(gè)氨基酸的插入，基因進(jìn)化樹結(jié)果顯示，該分離株位于相對獨(dú)立的分支，

3、與亞洲分離株親緣關(guān)系較近。100日齡健康豬攻毒比較結(jié)果顯示，PRVNJ株滴鼻接種組豬出現(xiàn)明顯臨床癥狀，攻毒后7d內(nèi)全部死亡，組織病理變化明顯，而傳統(tǒng)毒株LA接種組僅表現(xiàn)體溫變化與輕微呼吸道癥狀，組織病理變化輕微，表明PRV NJ分離毒株毒力明顯增強(qiáng)。
　　2.豬偽狂犬病病毒gB和gE蛋白單克隆抗體的制備與鑒定
　　本研究采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)獲得PRV超強(qiáng)毒株ZJ01 gB和gE重組蛋白，免疫BALB/c小鼠，通過細(xì)胞融合

4、、克隆和間接ELISA方法篩選，制備獲得4株能穩(wěn)定分泌抗PRV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)上清ELISA抗體效價(jià)為1∶1600～6400，腹水抗體效價(jià)達(dá)1∶4×105;連續(xù)培養(yǎng)20代，抗體效價(jià)基本一致?？筭B單抗B1B6和B3D7屬于IgG2b，抗gE單抗E1B11和E5C10屬于IgG1，輕鏈均為κ型。Western blot和IFA結(jié)果顯示，4株單抗均能與PRV流行毒株ZJ01、HZ、SD、NJ和LA發(fā)生特異性反應(yīng)，B1B6和B

5、3D7還能與PRV gE基因缺失疫苗毒株Bartha-K61發(fā)生反應(yīng)，但E1B11和E5C10b不能與Bartha-K61反應(yīng)，為PRV功能蛋白和抗體鑒別診斷試劑盒研制奠定了重要基礎(chǔ)，
　　3.豬偽狂犬病毒ZJ01毒株gB蛋白單克隆抗體的B細(xì)胞表位鑒定
　　為了對已獲得的2株抗PRV gB蛋白的單克隆抗體針對的抗原表位進(jìn)行定位，本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)截?cái)啾磉_(dá)了7個(gè)重組gB蛋白。通過SDS-PAGE和Western blot鑒

6、定目的蛋白成功表達(dá)后，再通過Western blot對2株抗PRVgB蛋白的單克隆抗體所識別的抗原表位進(jìn)行定位。結(jié)果顯示，抗gB單抗B1B6和B3D7識別相同的抗原表位E(104) YGDLDART(112)，與不同來源的PRV毒株進(jìn)行序列比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該表位在所參考毒株中高度保守。本研究為gB蛋白功能分析研究和PRV診斷方法的建立奠定了基礎(chǔ)。
　　4.豬鑄狂犬病病毒阻斷ELISA抗體檢測方法的建立與應(yīng)用
　　本研究采用

7、豬偽狂犬病毒(PRV)ZJ01毒株重組gB蛋白和HRP標(biāo)記單克隆抗體，建立檢測PRV gB抗體的阻斷ELISA方法，其優(yōu)化的反應(yīng)條件為:抗原包被濃度0.5μg·mL-1，待檢血清1∶1稀釋，作用時(shí)間37℃1h，酶標(biāo)單抗稀釋度為1∶15000，作用時(shí)間為37℃0.5h。血清樣品阻斷率PI≥28.67％時(shí)判為陽性，PI≤18.27％時(shí)判為陰性，18.27％＜PI＜28.67％時(shí)判為可疑。該方法與PRRSV、PCV2、CSFV和FMDV抗體陽