紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)狂犬病毒G抗體方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus，RV)引發(fā)的一種人獸共患傳染病，幾乎感染所有的溫血?jiǎng)游锖腿?，能引起急性致死性腦脊髓炎，一旦發(fā)病，病死率幾乎100％，是迄今為止，病死率最高的急性傳染病，已經(jīng)成為嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生的重大疫病。目前，尚無(wú)有效的藥物和方法治療狂犬病，主要以免疫為主，免疫后能否產(chǎn)生有效的保護(hù)抗體，建立一種行之有效的狂犬病抗體檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)十分重要，另外也可以通過(guò)抗體檢測(cè)進(jìn)行狂犬病診斷和疫苗評(píng)估。
　　 為

2、構(gòu)建具有凝集性、免疫反應(yīng)性的雙功能融合蛋白，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)出兩對(duì)特異性引物，從重組質(zhì)粒pMD-G和pMD-2E8ScFv中分別擴(kuò)增出Kg基因和2E8基因，通過(guò)SOE-PCR方法法拼接成融合基因2E8Kg，進(jìn)一步構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-Trx-2E8Kg，后轉(zhuǎn)入BL21(DE3)plysS中誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析表明，2E8Kg融合基因獲得了高效表達(dá)并主要以包涵體形式存在，表達(dá)量占菌體總蛋白的23.5％左右，分子量約為77.7 kD，

3、與預(yù)期大小一致。將表達(dá)的蛋白以親和層析法進(jìn)行純化并通過(guò)谷胱甘肽還原法進(jìn)行復(fù)性，純化后蛋白純度達(dá)到98.9％。經(jīng)Western-blot檢測(cè)和紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)證明，2E8Kg融合蛋白既能夠與狂犬病毒(RV)高免血清發(fā)生特異性反應(yīng)，又能夠與人紅細(xì)胞結(jié)合，具有雙功能特性。
　　 以此雙功能融合蛋白為檢測(cè)抗原，以人‘0’型紅細(xì)胞作為指示細(xì)胞，建立了快速檢測(cè)狂犬病毒G抗體的方法。通過(guò)方陣滴定試驗(yàn)篩選出檢測(cè)抗原最佳稀釋度為1:16，對(duì)應(yīng)的工作

4、濃度為106.26μg/mL，血清最佳稀釋度為1:16，作用時(shí)間25 min。利用該方法檢測(cè)犬細(xì)小病毒(CPV)、犬瘟熱病毒(CDV)陽(yáng)性血清均無(wú)凝集，與RV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清反應(yīng)出現(xiàn)強(qiáng)凝集，表明該方法特異性強(qiáng)。用不同批次制備的檢測(cè)抗原重復(fù)檢測(cè)狂犬病毒陽(yáng)、陰性標(biāo)準(zhǔn)血清，檢測(cè)結(jié)果完全一致，具有很好的重復(fù)性。將紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)與熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(FAVNT)作平行比對(duì)，通過(guò)對(duì)臨床1086份犬血清的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血凝價(jià)大于或等于1:16(相當(dāng)于F