豬乙型腦炎病毒ELISA抗體檢測方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、日本乙型腦炎（Japanese encephalitis，JE）簡稱乙腦，是由黃病毒科的乙型腦炎病毒（JE virus，JEV）引起的人畜共患性傳染病。豬是本病的擴(kuò)散宿主，主要引起豬的繁殖障礙性疾病。豬群中高水平的抗體有助于抵抗病毒傳播，這在規(guī)?；B(yǎng)豬場有重要意義，也有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。因此，建立和完善乙型腦炎抗體水平的評價(jià)方法至關(guān)重要。
　　 本課題通過對比不同的ELISA方法，選擇建立基于地鼠原代腎細(xì)胞病毒抗原的ELIS

2、A方法，主要包括以下三方面研究：
　　 1．病毒抗原的制備以及原核表達(dá)產(chǎn)物抗原的制備
　　 首先，將金黃地鼠原代腎細(xì)胞以及BHK-21細(xì)胞用于乙腦病毒（SA14-14-2株）的增殖，經(jīng)硫酸銨沉淀法純化病毒，作為抗原。同時(shí)，將病毒在7日齡雞胚中增殖，收取病毒尿囊液并使用丙酮沉淀法制備病毒抗原。另外，采用原核系統(tǒng)表達(dá)乙腦病毒囊膜糖蛋白基因（E基因），提純表達(dá)的E蛋白包涵體作為蛋白抗原。
　　 2．三種不同抗原包被的E

3、LISA方法與康柏德ELISA試劑盒的比較
　　 以康柏德豬乙腦ELISA抗體檢測試劑盒為標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)用以上三種抗原建立的ELISA方法檢測72份豬血清。原代細(xì)胞源病毒抗原包被間接ELISA方法、雞胚源病毒抗原包被的間接ELISA方法、E蛋白抗原包被的間接ELISA方法與標(biāo)準(zhǔn)試劑盒的符合率分別為82％、66.6％、58.3％。確定用原代腎細(xì)胞源病毒抗原用作包被抗原，用于豬乙腦ELISA抗體試劑盒的開發(fā)。
　　 3．地鼠原代

4、腎細(xì)胞源病毒抗原作為包被抗原的ELISA方法研究
　　 方陣滴定確定該ELISA方法抗原的最佳包被濃度為1：3200，即4.5ug/mL，血清稀釋液（正常BHK-21細(xì)胞懸液作為血清稀釋液母液）最佳使用濃度為1：320，血清稀釋度固定為1：100。檢測115份乙腦抗體陰性血清，計(jì)算得該1份陰性血清平均值（X）為0.155，標(biāo)準(zhǔn)差（SD）為0.045，確定陰陽性臨界點(diǎn)（X+3SD）為0.29。以該方法檢測豬偽狂犬病、豬瘟、豬細(xì)小病

5、毒、豬繁殖與呼吸綜合征、弓形體、副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌、豬支氣管敗血波氏桿菌的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果均為陰性。14份豬血清的重復(fù)試驗(yàn)，批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)在0.16％～8.53％之間，變異系數(shù)（CV）<5％；批間重復(fù)變異系數(shù)在0.63％～17.2％之間，變異系數(shù)（CV）<5％。保存期試驗(yàn)表明，建立的試劑盒在37℃該方法可保存3天，在4℃可以保存4個(gè)月左右。該方法與康柏德豬乙腦ELISA抗體檢測試劑盒的陽性符合率為84.6％，陰性