鈣信號轉(zhuǎn)導途徑在自體移植皮片過度色素沉著中的作用.pdf

1、一、研究背景
　　 自體皮片移植是整形外科常用手術方法之一，在修復創(chuàng)面、改善外形、恢復功能等方面發(fā)揮了重要作用。但移植皮片成活后常伴有不同程度的過度色素沉著，從而影響了手術的美容效果，如何減輕移植皮片后的色素沉著是困擾整形外科醫(yī)生的一大難題。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)α-黑素細胞刺激素（α-melanocyte-stimulating hormone,α-MSH）在自體移植皮片中呈過度表達，通過與黑素細胞表面特異性受體－黑皮素-1

2、受體（melanocortin-1receptor, MC-1R）結(jié)合后促進黑素細胞合成黑素增多，并促進黑素小體擴散，使自體移植皮片呈過度色素沉著表現(xiàn)。其他作者研究發(fā)現(xiàn)，鈣信號轉(zhuǎn)導途徑參與α-MSH 前體的合成、黑色素合成原材料的供給、黑素細胞增殖、酪氨酸酶的合成及黑素小體轉(zhuǎn)運等多個環(huán)節(jié)，從而參與調(diào)控黑素細胞中黑素的合成。還有其他研究表明α-MSH與黑素細胞表面MC-1R 結(jié)合可使細胞鈣內(nèi)流增加、胞內(nèi)鈣水平升高，激活細胞內(nèi)鈣信號轉(zhuǎn)導途徑

3、。
　　 以上研究說明，α-MSH的合成、黑素細胞中酪氨酸酶的激活、黑素的合成等都需要鈣信號的參與調(diào)節(jié)；因此，鈣信號轉(zhuǎn)導途徑在自體移植皮片中對色素沉著的調(diào)控作用，以及其與α-MSH 促進黑素細胞合成黑色素的通路之間的關系值得進一步研究。
　　 二、研究目的(一) 檢測CaM、IP3RI及TYR在人體自體移植皮片中的表達，并與自身正常皮膚作對照，認識鈣信號轉(zhuǎn)導途徑在自體移植皮片過度色素沉著中的作用。
　　 (二)

4、觀察維拉帕米對人皮膚黑素細胞胞內(nèi)鈣離子濃度、細胞的增殖、CaM、TYR、IP3RI的表達及黑色素合成的影響，探討鈣信號轉(zhuǎn)導途徑在黑素細胞合成黑色素中的調(diào)控作用及環(huán)節(jié)。
　　 (三) 觀察維拉帕米與α-MSH 共同作用后對人皮膚黑素細胞的增殖、CaM、TYR、IP3RI的表達及黑色素合成的影響，探討鈣信號轉(zhuǎn)導途徑與α-MSH在黑素細胞合成黑色素中相互作用。
　　 (四) 觀察維拉帕米在體內(nèi)對自體移植皮片色素沉著的影響，進一

5、步闡述鈣信號轉(zhuǎn)導途徑對自體移植皮片色素沉著中的調(diào)控作用。
　　 三、研究內(nèi)容和方法(一) 利用免疫組織化學方法和Realtime-PCR 方法分別檢測自體移植皮片(刃厚、中厚及全厚皮片)與正常對照皮膚中CaM、TYR及IP3RI的表達情況，銀染-麗春紅(Masson Fontana-Ponceau)復合法檢測自體移植皮片中黑色素的含量，并進行統(tǒng)計學分析。
　　 (二) 用含不同濃度維拉帕米的條件培養(yǎng)基作用于人皮膚黑素細胞

6、后，通過熒光抗體標記法檢測黑素細胞胞內(nèi)鈣離子濃度、MTT 法觀察人皮膚黑素細胞的增殖，Western-blot及Realtime-PCR 方法分別檢測人皮膚黑素細胞中CaM、TYR及IP3RI蛋白和基因表達，多巴氧化法測定TYR 活性的變化及NaOH 裂解法測定細胞中黑素的含量，并進行統(tǒng)計學分析。
　　 (三) 檢測維拉帕米與α-MSH 共同作用人黑素細胞后，細胞增殖、TYR 活性、黑素含量、CaM、TYR及IP3RI的表達并與

7、對照組相比較。
　　 (四) 利用免疫組織化學方法及Realtime-PCR 法分別檢測維拉帕米作用前后豚鼠自體移植皮片中CaM和TYR的表達，銀染-麗春紅(Masson Fontana-Ponceau)復合法檢測自體移植皮片表皮中黑色素的含量，并進行統(tǒng)計學分析。
　　 四、研究結(jié)果(一) 應用免疫組織化學方法，觀察到CaM的表達定位于表皮基底部黑素細胞、角質(zhì)形成細胞胞質(zhì)，TYR的表達定位于表皮基底部黑素細胞胞質(zhì)，IP3

8、RI的表達定位于表皮基底部黑素細胞、角質(zhì)形成細胞的細胞質(zhì)，它們在自體移植皮片中蛋白表達較正常皮膚明顯上調(diào)；通過Realtime-PCR 方法檢測，CaM及TYR基因在自體移植皮片中的表達較正常皮膚亦明顯上調(diào)。
　　 (二) 維拉帕米能明顯降低黑素細胞胞內(nèi)鈣離子濃度、抑制黑素細胞增殖、下調(diào)CaM和TYR的表達，降低TYR的活性而減少黑色素的合成。
　　 (三) 維拉帕米通過抑制鈣信號轉(zhuǎn)導作用能拮抗α-MSH對黑素細胞合成黑

9、色素的促進作用，抑制黑素細胞增殖、下調(diào)CaM和TYR的表達，降低TYR的活性而減少黑色素的合成。(四) 利用免疫組織化學方法及Realtime-PCR 法，在維拉帕米作用后皮片中黑素含量、CaM、TYR的蛋白及基因表達與未處理組相比均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義，而與正常豚鼠相比差異無統(tǒng)計學意義。
　　 五、研究結(jié)論CaM在人自體移植皮片中的表達顯著增高，刺激皮片黑素細胞合成黑色素增多，促進自體移植皮片過度色素沉著；維拉帕米作用于