10024.grks和βarrestins在gpcrs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中作用的實(shí)驗(yàn)研究

1、分類號(hào)：Q331校單位代碼：10446碩士學(xué)位論文論文題目：論文題目：GRKs和βarrestins在GPCRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中作用的實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)研究研究生姓名：田艷君學(xué)科、專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究方向：分子生物學(xué)導(dǎo)師姓名、職稱：白波教授陳京教授論文完成時(shí)間：2014年4月曲阜師范大學(xué)2014屆碩士研究生畢業(yè)論文Ⅰ摘要G蛋白偶聯(lián)受體（GproteincoupledreceptsGPCRs）是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最大的細(xì)胞表面受

2、體超家族，可將多種細(xì)胞外物理性和化學(xué)性信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)，并通過與其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相互作用來調(diào)控各種生理功能。配體與GPCRs結(jié)合后，不僅能激活異源三聚體G蛋白，還可以引發(fā)G蛋白偶聯(lián)受體激酶（GproteincoupledreceptkinasesGRKs）參與GPCRs的磷酸化。通常情況下，抑制蛋白（βarrestins）會(huì)迅速與磷酸化的GPCRs結(jié)合，削弱受體通過G蛋白對(duì)刺激物的應(yīng)答作用。本實(shí)驗(yàn)擬以孤啡肽受體（opioidrecept

3、like1receptL1）及apelin受體（putativereceptproteinrelatedtoAT1APJ）為主要研究對(duì)象，分析GPCRs調(diào)節(jié)因子GRKs和βarrestins在這兩種受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，探討GPCRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用途徑和作用機(jī)制，為臨床治療提供新的策略和藥物靶點(diǎn)積累資料。本實(shí)驗(yàn)采用分子克隆方法構(gòu)建含人L1、APJ及其突變體以及GRKs的各種真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞（HEK293T細(xì)胞），利用生物發(fā)

4、光共振能量轉(zhuǎn)移（biolumininescenceresonanceenergytransferBRET）、激光共聚焦掃描顯微鏡等技術(shù)實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)地研究活細(xì)胞中GRKs、βarrestins與L1、APJ的相互作用特點(diǎn)。同時(shí)，借助酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzymelinkedimmunosbentassayELISA）檢測細(xì)胞表面受體表達(dá)水平，分析配體誘導(dǎo)的受體內(nèi)化的特點(diǎn)?；驕y序證實(shí)，一系列的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，包括L1Venus、L1Rlu

5、c、EGFPL1、GRK23Rluc以及APJ突變體APJS335ARluc、APJS345ARluc、APJS348ARluc、HAAPJS348A等均構(gòu)建正確，可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。經(jīng)BRET檢測，給予L1特異性激動(dòng)劑NOFQ后，L1既可以與Gαio結(jié)合，又能與GRK3、βarrestin2產(chǎn)生相互作用，但與細(xì)胞膜定位蛋白Kras（KRas）的作用則會(huì)明顯減弱。BRET2結(jié)果顯示，在apelin13作用下，野生型APJ與GRK2和GRK5

6、均可發(fā)生相互作用，突變體APJS335A和APJS345A出現(xiàn)與野生型類似的效應(yīng)；而APJS348A與GRK2和GRK5均不能產(chǎn)生BRET信號(hào)。ELISA實(shí)驗(yàn)表明：采用NOFQ處理細(xì)胞30min后，細(xì)胞表面L1水平降低，尤其當(dāng)GRK3或βarrestin2存在時(shí)，L1受體水平降低更加顯著（p＜0.01），L1出現(xiàn)明顯內(nèi)化；采用apelin13孵育細(xì)胞30min后，野生型APJ出現(xiàn)明顯內(nèi)化，當(dāng)βarrestins存在時(shí)內(nèi)化更顯著；但突變體

7、APJS348A，即便有βarrestins的存在，也未發(fā)現(xiàn)明顯的內(nèi)化現(xiàn)象。采用BRET技術(shù)研究L1和APJ的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，L1和APJ存在BRET現(xiàn)象，可形成二聚體，結(jié)果顯示此二聚化是配體非依賴性的。激光共聚焦顯微鏡技術(shù)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluescenceresonanceenergytransferFRET）檢測也得到了一致的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，激動(dòng)劑作用下，GPCRs不僅可以通過G蛋白依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮作用，還可經(jīng)由