離子液體促進(jìn)抗生素抗性基因水平轉(zhuǎn)移及機(jī)理研究.pdf

1、環(huán)境中廣泛存在的抗生素和抗生素抗性基因會(huì)導(dǎo)致很?chē)?yán)重的人類(lèi)健康風(fēng)險(xiǎn)。環(huán)境中殘留的抗生素所產(chǎn)生的選擇性壓力被認(rèn)為是抗生素抗性基因出現(xiàn)、存在和傳播的最主要因素。但是，很多報(bào)道又發(fā)現(xiàn)在從來(lái)沒(méi)有使用過(guò)抗生素的環(huán)境介質(zhì)中也檢測(cè)到了抗性基因的存在?？股乜剐曰蛑饕ㄟ^(guò)接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式在相同種屬或者不同種屬的細(xì)菌之間發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致抗性基因在環(huán)境中的傳播擴(kuò)散。除了抗生素對(duì)抗性基因的篩選作用外，其他環(huán)境選擇性壓力如重金屬、消毒劑、洗滌劑、生

2、物殺滅劑和納米材料等都可以通過(guò)增強(qiáng)水平轉(zhuǎn)移來(lái)促進(jìn)抗生素抗性基因在環(huán)境中的傳播。
　　離子液體作為一種“環(huán)境友好型”溶劑，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于能源，生物技術(shù)，化學(xué)合成，化學(xué)工程，高分子材料，納米技術(shù)等領(lǐng)域?，F(xiàn)在還沒(méi)有關(guān)于離子液體直接在環(huán)境介質(zhì)中檢測(cè)的報(bào)道，但為了預(yù)防環(huán)境中離子液體的污染，現(xiàn)在很多研究已經(jīng)開(kāi)始關(guān)注離子液體在環(huán)境中的毒理、降解、歸趨和環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。離子液體對(duì)細(xì)菌的毒理機(jī)制主要通過(guò)攻擊細(xì)菌細(xì)胞膜的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)使細(xì)胞膜受損，引起細(xì)胞膜

3、通透性改變甚至改變細(xì)胞膜的組成成分。而細(xì)胞膜是細(xì)菌同屬或跨屬之間，細(xì)菌通過(guò)水平轉(zhuǎn)移進(jìn)行基因交換的重要阻礙。而細(xì)胞膜的通透性的增加可以降低細(xì)胞膜對(duì)細(xì)胞與細(xì)胞之間相互接觸甚至進(jìn)行基因水平轉(zhuǎn)移的阻礙。到目前為止，離子液體是否可以促進(jìn)細(xì)菌的水平轉(zhuǎn)移從而增強(qiáng)抗生素抗性基因的傳播和擴(kuò)散尚不清楚。
　　首先建立了微宇宙環(huán)境水樣體系，考察離子液體1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([BMIm][PF6])作為一種環(huán)境選擇性壓力促進(jìn)抗生素抗性基因在水

4、環(huán)境中的傳播擴(kuò)散。在微宇宙環(huán)境水樣體系中，離子液體[BMIm][PF6]的暴露顯著地促進(jìn)了intI、sulI和sulII基因含量的升高，并且含量都隨離子液體[BMIm][PF6]濃度(0.001-0.5g/L)的增加而增加。但抗性基因sulI和intI含量的增加均不是總細(xì)菌量的變化引起的。同時(shí)，磺胺類(lèi)抗性基因sulI和sulII在水環(huán)境中的存在和傳播的機(jī)理存在差異?；騭ulI與intI的絕對(duì)含量具有正相關(guān)性，但基因sulII與intI

5、的絕對(duì)含量沒(méi)有相關(guān)性。通過(guò)環(huán)境水樣中篩選的土著菌Alcaligenes sp.（供體菌）和Acinetobacter sp.（受體菌）構(gòu)建的I類(lèi)整合子水平轉(zhuǎn)移體系和DNA測(cè)序技術(shù)證實(shí)了sulI在微宇宙環(huán)境水樣中的傳播擴(kuò)散是由I類(lèi)整合子介導(dǎo)的，而sulII的傳播擴(kuò)散與I類(lèi)整合子介導(dǎo)抗性基因傳播無(wú)關(guān)。離子液體[BMIm][PF6]作為一種選擇性壓力，通過(guò)促進(jìn)I類(lèi)整合子在環(huán)境土著菌之間的水平轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致抗性基因sulI和intI含量的增加。

6、r>　　進(jìn)一步我們利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建了含質(zhì)粒RP4的E.coli K12，并以E.coli K12（RP4）為供體菌，選擇天津水上公園的環(huán)境水樣土著菌為受體，構(gòu)建了相對(duì)復(fù)雜的具有一定室外水環(huán)境條件的水平轉(zhuǎn)移體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒 RP4介導(dǎo)的水平轉(zhuǎn)移頻率隨離子液體[BMIm][PF6]濃度(0.001-1.0g/L)的增加而增加，1.0g/L[BMIm][PF6]暴露下的水平轉(zhuǎn)移頻率是對(duì)照組(0g/L[BMIm][PF6])的60倍。

7、同時(shí)，通過(guò)定量PCR（q-PCR）技術(shù)，首次以多重耐藥質(zhì)粒RP4為指示標(biāo)志物，動(dòng)態(tài)追蹤抗性基因在離子液體[BMIm][PF6]暴露的微宇宙環(huán)境水樣水平轉(zhuǎn)移體系中的歸趨。研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒RP4水平轉(zhuǎn)移頻率的增長(zhǎng)趨勢(shì)和traF基因（質(zhì)粒RP4指示基因）的增加趨勢(shì)一致。同時(shí)，aphA基因（質(zhì)粒RP4上攜帶的卡那霉素抗性基因）的相對(duì)含量和traF基因的相對(duì)含量呈正相關(guān)(p<0.01),這意味著aphA抗性基因的傳播擴(kuò)散是由于離子液體[BMIm][P

8、F6]促進(jìn)質(zhì)粒RP4水平轉(zhuǎn)移引起的。本研究充分闡明了離子液體[BMIm][PF6]通過(guò)促進(jìn)質(zhì)粒RP4介導(dǎo)的水平轉(zhuǎn)移來(lái)增強(qiáng)抗生素抗性基因在水環(huán)境中的傳播。
　　同時(shí)，在微宇宙環(huán)境水樣的水平轉(zhuǎn)移體系中，利用16S rRNA測(cè)序方法對(duì)平板影印法篩選到的接合轉(zhuǎn)化子（質(zhì)粒RP4土著受體菌）進(jìn)行了重點(diǎn)考察。發(fā)現(xiàn)在環(huán)境水樣土著受體菌落中，革蘭氏陰性菌Acinetobacter spp.,Alcaligenes spp.,Achromobacte

9、r spp.和Pseudomonas spp.是主要的質(zhì)粒RP4受體。而且，革蘭氏陰性菌Salmonella spp.中的水平轉(zhuǎn)移頻率是革蘭氏陽(yáng)性菌microbacterium spp.中水平轉(zhuǎn)移頻率的3倍，這意味著革蘭氏陰性菌更容易通過(guò)質(zhì)粒RP4的水平轉(zhuǎn)移獲得抗生素抗性基因。值得注意的是，土著受體菌中兩株條件致病菌Acinetobacter spp.和Salmonella spp.都是革蘭氏陰性菌，這也增加了抗生素抗性基因向人類(lèi)致病菌

10、傳播的風(fēng)險(xiǎn)，從而對(duì)公共健康產(chǎn)生更嚴(yán)重的威脅。
　　為了研究離子液體促進(jìn)抗生素抗性基因傳播擴(kuò)散的機(jī)理，建立以同屬的E.coli DH5α(RP4)和E.coli HB101，跨屬的E.coli DH5α(RP4)和Salmonella之間的純菌接合轉(zhuǎn)移體系，從細(xì)胞水平、mRNA基因表達(dá)調(diào)控水平和蛋白表達(dá)水平闡明離子液體[BMIm][PF6]促進(jìn)質(zhì)粒RP4接合轉(zhuǎn)移的機(jī)理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)四大類(lèi)離子液體均能促進(jìn)質(zhì)粒RP4的水平轉(zhuǎn)移，離子液體[B

11、MIm][BF4]促進(jìn)質(zhì)粒RP4接合轉(zhuǎn)移就是離子液體陰、陽(yáng)離子自身作用的結(jié)果，而且不同陰、陽(yáng)離子促進(jìn)質(zhì)粒RP4水平轉(zhuǎn)移的程度不同。
　　在同屬和跨屬接合轉(zhuǎn)移體系中，離子液體[BMIm][PF6]促進(jìn)質(zhì)粒RP4水平傳播主要是通過(guò)接合轉(zhuǎn)移而不是轉(zhuǎn)化。接合轉(zhuǎn)移頻率都隨離子液體[BMIm][PF6]濃度的增加而增加(0.001-0.5g/L)。質(zhì)粒RP4在E.coli DH5α和E.coli HB101同屬之間的接合轉(zhuǎn)移頻率明顯要高于在E

12、.coli DH5α和Salmonella enterica跨屬之間的接合轉(zhuǎn)移頻率，這主要是因?yàn)橥瑢俳雍限D(zhuǎn)移中基因trbK的mRNA表達(dá)水平比跨屬接合轉(zhuǎn)移中基因trbK的mRNA表達(dá)水平低。mRNA基因表達(dá)調(diào)控水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)離子液體[BMIm][PF6]通過(guò)抑制基因korA, korB和trbA的mRNA表達(dá)水平來(lái)提高接合和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)基因trbBp和trfAp的表達(dá)；增強(qiáng)水平轉(zhuǎn)移基因TraF的mRNA表達(dá)水平，并通過(guò)增強(qiáng)負(fù)調(diào)控基因kilA和

13、kilB的mRNA表達(dá)水平抑制質(zhì)粒的垂直傳遞過(guò)程；通過(guò)抑制基因trbK的mRNA表達(dá)水平降低接合轉(zhuǎn)移體系的排斥效果，從而促進(jìn)質(zhì)粒RP4的接合轉(zhuǎn)移。細(xì)胞膜通透性（流式細(xì)胞儀檢測(cè)）和蛋白表達(dá)研究（SDS-PAGE和噬菌體M13侵染實(shí)驗(yàn)）結(jié)果表明離子液體[BMIm][PF6]的暴露使受體菌內(nèi)孔蛋白OmpC和OmpA的表達(dá)含量升高，從而增強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，有助于降低細(xì)胞膜對(duì)細(xì)菌之間接合的阻礙，使質(zhì)粒RP4能更容易地跨過(guò)受體菌細(xì)胞膜而進(jìn)入受體