離子液體促進抗生素抗性基因水平轉(zhuǎn)移及機理研究.pdf

1、環(huán)境中廣泛存在的抗生素和抗生素抗性基因會導(dǎo)致很嚴重的人類健康風(fēng)險。環(huán)境中殘留的抗生素所產(chǎn)生的選擇性壓力被認為是抗生素抗性基因出現(xiàn)、存在和傳播的最主要因素。但是，很多報道又發(fā)現(xiàn)在從來沒有使用過抗生素的環(huán)境介質(zhì)中也檢測到了抗性基因的存在?？股乜剐曰蛑饕ㄟ^接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式在相同種屬或者不同種屬的細菌之間發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致抗性基因在環(huán)境中的傳播擴散。除了抗生素對抗性基因的篩選作用外，其他環(huán)境選擇性壓力如重金屬、消毒劑、洗滌劑、生

2、物殺滅劑和納米材料等都可以通過增強水平轉(zhuǎn)移來促進抗生素抗性基因在環(huán)境中的傳播。
　　離子液體作為一種“環(huán)境友好型”溶劑，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于能源，生物技術(shù)，化學(xué)合成，化學(xué)工程，高分子材料，納米技術(shù)等領(lǐng)域?，F(xiàn)在還沒有關(guān)于離子液體直接在環(huán)境介質(zhì)中檢測的報道，但為了預(yù)防環(huán)境中離子液體的污染，現(xiàn)在很多研究已經(jīng)開始關(guān)注離子液體在環(huán)境中的毒理、降解、歸趨和環(huán)境生態(tài)風(fēng)險。離子液體對細菌的毒理機制主要通過攻擊細菌細胞膜的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)使細胞膜受損，引起細胞膜

3、通透性改變甚至改變細胞膜的組成成分。而細胞膜是細菌同屬或跨屬之間，細菌通過水平轉(zhuǎn)移進行基因交換的重要阻礙。而細胞膜的通透性的增加可以降低細胞膜對細胞與細胞之間相互接觸甚至進行基因水平轉(zhuǎn)移的阻礙。到目前為止，離子液體是否可以促進細菌的水平轉(zhuǎn)移從而增強抗生素抗性基因的傳播和擴散尚不清楚。
　　首先建立了微宇宙環(huán)境水樣體系，考察離子液體1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([BMIm][PF6])作為一種環(huán)境選擇性壓力促進抗生素抗性基因在水

4、環(huán)境中的傳播擴散。在微宇宙環(huán)境水樣體系中，離子液體[BMIm][PF6]的暴露顯著地促進了intI、sulI和sulII基因含量的升高，并且含量都隨離子液體[BMIm][PF6]濃度(0.001-0.5g/L)的增加而增加。但抗性基因sulI和intI含量的增加均不是總細菌量的變化引起的。同時，磺胺類抗性基因sulI和sulII在水環(huán)境中的存在和傳播的機理存在差異。基因sulI與intI的絕對含量具有正相關(guān)性，但基因sulII與intI

5、的絕對含量沒有相關(guān)性。通過環(huán)境水樣中篩選的土著菌Alcaligenes sp.（供體菌）和Acinetobacter sp.（受體菌）構(gòu)建的I類整合子水平轉(zhuǎn)移體系和DNA測序技術(shù)證實了sulI在微宇宙環(huán)境水樣中的傳播擴散是由I類整合子介導(dǎo)的，而sulII的傳播擴散與I類整合子介導(dǎo)抗性基因傳播無關(guān)。離子液體[BMIm][PF6]作為一種選擇性壓力，通過促進I類整合子在環(huán)境土著菌之間的水平轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致抗性基因sulI和intI含量的增加。

6、r>　　進一步我們利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建了含質(zhì)粒RP4的E.coli K12，并以E.coli K12（RP4）為供體菌，選擇天津水上公園的環(huán)境水樣土著菌為受體，構(gòu)建了相對復(fù)雜的具有一定室外水環(huán)境條件的水平轉(zhuǎn)移體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒 RP4介導(dǎo)的水平轉(zhuǎn)移頻率隨離子液體[BMIm][PF6]濃度(0.001-1.0g/L)的增加而增加，1.0g/L[BMIm][PF6]暴露下的水平轉(zhuǎn)移頻率是對照組(0g/L[BMIm][PF6])的60倍。

7、同時，通過定量PCR（q-PCR）技術(shù)，首次以多重耐藥質(zhì)粒RP4為指示標志物，動態(tài)追蹤抗性基因在離子液體[BMIm][PF6]暴露的微宇宙環(huán)境水樣水平轉(zhuǎn)移體系中的歸趨。研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒RP4水平轉(zhuǎn)移頻率的增長趨勢和traF基因（質(zhì)粒RP4指示基因）的增加趨勢一致。同時，aphA基因（質(zhì)粒RP4上攜帶的卡那霉素抗性基因）的相對含量和traF基因的相對含量呈正相關(guān)(p<0.01),這意味著aphA抗性基因的傳播擴散是由于離子液體[BMIm][P

8、F6]促進質(zhì)粒RP4水平轉(zhuǎn)移引起的。本研究充分闡明了離子液體[BMIm][PF6]通過促進質(zhì)粒RP4介導(dǎo)的水平轉(zhuǎn)移來增強抗生素抗性基因在水環(huán)境中的傳播。
　　同時，在微宇宙環(huán)境水樣的水平轉(zhuǎn)移體系中，利用16S rRNA測序方法對平板影印法篩選到的接合轉(zhuǎn)化子（質(zhì)粒RP4土著受體菌）進行了重點考察。發(fā)現(xiàn)在環(huán)境水樣土著受體菌落中，革蘭氏陰性菌Acinetobacter spp.,Alcaligenes spp.,Achromobacte

9、r spp.和Pseudomonas spp.是主要的質(zhì)粒RP4受體。而且，革蘭氏陰性菌Salmonella spp.中的水平轉(zhuǎn)移頻率是革蘭氏陽性菌microbacterium spp.中水平轉(zhuǎn)移頻率的3倍，這意味著革蘭氏陰性菌更容易通過質(zhì)粒RP4的水平轉(zhuǎn)移獲得抗生素抗性基因。值得注意的是，土著受體菌中兩株條件致病菌Acinetobacter spp.和Salmonella spp.都是革蘭氏陰性菌，這也增加了抗生素抗性基因向人類致病菌

10、傳播的風(fēng)險，從而對公共健康產(chǎn)生更嚴重的威脅。
　　為了研究離子液體促進抗生素抗性基因傳播擴散的機理，建立以同屬的E.coli DH5α(RP4)和E.coli HB101，跨屬的E.coli DH5α(RP4)和Salmonella之間的純菌接合轉(zhuǎn)移體系，從細胞水平、mRNA基因表達調(diào)控水平和蛋白表達水平闡明離子液體[BMIm][PF6]促進質(zhì)粒RP4接合轉(zhuǎn)移的機理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)四大類離子液體均能促進質(zhì)粒RP4的水平轉(zhuǎn)移，離子液體[B

11、MIm][BF4]促進質(zhì)粒RP4接合轉(zhuǎn)移就是離子液體陰、陽離子自身作用的結(jié)果，而且不同陰、陽離子促進質(zhì)粒RP4水平轉(zhuǎn)移的程度不同。
　　在同屬和跨屬接合轉(zhuǎn)移體系中，離子液體[BMIm][PF6]促進質(zhì)粒RP4水平傳播主要是通過接合轉(zhuǎn)移而不是轉(zhuǎn)化。接合轉(zhuǎn)移頻率都隨離子液體[BMIm][PF6]濃度的增加而增加(0.001-0.5g/L)。質(zhì)粒RP4在E.coli DH5α和E.coli HB101同屬之間的接合轉(zhuǎn)移頻率明顯要高于在E

12、.coli DH5α和Salmonella enterica跨屬之間的接合轉(zhuǎn)移頻率，這主要是因為同屬接合轉(zhuǎn)移中基因trbK的mRNA表達水平比跨屬接合轉(zhuǎn)移中基因trbK的mRNA表達水平低。mRNA基因表達調(diào)控水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)離子液體[BMIm][PF6]通過抑制基因korA, korB和trbA的mRNA表達水平來提高接合和跨膜轉(zhuǎn)運基因trbBp和trfAp的表達；增強水平轉(zhuǎn)移基因TraF的mRNA表達水平，并通過增強負調(diào)控基因kilA和

13、kilB的mRNA表達水平抑制質(zhì)粒的垂直傳遞過程；通過抑制基因trbK的mRNA表達水平降低接合轉(zhuǎn)移體系的排斥效果，從而促進質(zhì)粒RP4的接合轉(zhuǎn)移。細胞膜通透性（流式細胞儀檢測）和蛋白表達研究（SDS-PAGE和噬菌體M13侵染實驗）結(jié)果表明離子液體[BMIm][PF6]的暴露使受體菌內(nèi)孔蛋白OmpC和OmpA的表達含量升高，從而增強細菌細胞膜的通透性，有助于降低細胞膜對細菌之間接合的阻礙，使質(zhì)粒RP4能更容易地跨過受體菌細胞膜而進入受體