嗜線蟲致病桿菌北京變種抗生素抗性相關(guān)基因的研究.pdf

1、本研究對嗜線蟲致病桿菌北京變種的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化技術(shù)進行了探討，對菌株的抗生素相關(guān)基因片段進行克隆、功能分析和定位，為菌株的遺傳改良提供技術(shù)支持與理論依據(jù)，同時為獲得新的功能基因奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下： 1)測定了嗜線蟲致病桿菌北京變種Ⅰ型菌的抗生素抗性。北京變種對氯霉素、新霉素和卡那霉素敏感；對鏈霉素、氨芐青霉素和青霉素具有一定的抗性。 2)首次研究了不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法對北京變種Ⅰ型菌株生理生化特性的影響，確定接合轉(zhuǎn)移是適宜

2、菌株遺傳操作的最佳方法。用不同方法制備北京變種Ⅰ型菌的感受態(tài)細(xì)胞，不同方法對菌株影響各異：經(jīng)電擊操作處理的菌株出現(xiàn)卡那霉素抗性，API試條中V-P反應(yīng)、蔗糖(SAC)、葡萄糖(GLU)和山梨醇(SOR)利用發(fā)生了變化，生長曲線呈雙S型，抑菌活性降低；經(jīng)CaCl2介導(dǎo)的化學(xué)轉(zhuǎn)化操作的菌株其卡那霉素抗性、色素吸收、抑菌活性及生理生化特性也受到影響；而接合轉(zhuǎn)移操作處理方法對菌株影響最小，各方面的特性與野生型菌株基本一致。 3)首次利用

3、接合轉(zhuǎn)移的三親雜交方法，建立了北京變種Ⅰ型菌株外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體系。分別將質(zhì)粒pSZ21和pLA2917轉(zhuǎn)化到北京變種Ⅰ型細(xì)胞中，對菌株的許多代謝途徑及性狀產(chǎn)生了較大影響。與野生型菌株相比，分別含有外源質(zhì)粒pSZ21和pLA2917的轉(zhuǎn)移接合子在NBTA培養(yǎng)基上呈暗紅色菌落；生長速度明顯提高，提前12小時進入指數(shù)生長期；一些生理生化反應(yīng)特別是糖類利用所受影響較大；菌株產(chǎn)素水平也因為質(zhì)粒的導(dǎo)入而呈大幅度降低的態(tài)勢。 4)首次從北京變種

4、中克隆得到抗生素相關(guān)基因xbl基因片段。在GenBank提交注冊(AccessionNo.：DQ631811)。xbl基因片段的15～731堿基與嗜線蟲致病桿菌ATCC19061菌株次級代謝物生物合成功能蛋白對應(yīng)區(qū)域同源性為99％，17～731堿基與發(fā)光光桿狀菌TTO1菌株抗生素生物合成類似蛋白的編碼基因具有85％的序列相似性。 5)對北京變種具有氨芐青霉素水解活性的xbl-ah基因片段進行原核表達(dá)、蛋白純化及生物活性測定。設(shè)計

5、引物從北京變種Ⅰ型細(xì)菌中擴增得到xbl-ah序列，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28AH，轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)細(xì)胞中，SDS-PAGE和Westernblotting證明該肽段異源表達(dá)成功。在不同IPTG濃度、溫度以及時間等誘導(dǎo)條件下，發(fā)現(xiàn)目的肽段均以包涵體的形式表達(dá)。包涵體經(jīng)溶解、變性、透析復(fù)性后表現(xiàn)出氨芐青霉素水解活性。對XBL-AH復(fù)性產(chǎn)物用AKTA系統(tǒng)進行親和層析純化，并用ELISA進行驗證。 6)對xbl-ah