環(huán)境中抗生素抗性基因污染的初步研究.pdf

1、近年來，排放到環(huán)境中的藥物及其潛在的影響引起了越來越多的科學(xué)家的關(guān)注?？股乜剐曰?Antibiotic resistance genes，ARGs)導(dǎo)致的對抗生素有抗性的病原體的傳播是本世紀(jì)對人類健康生活最嚴(yán)重的威脅之一。ARGs在環(huán)境中的持久性殘留，以及在不同環(huán)境介質(zhì)中的遷移、轉(zhuǎn)化往往比抗生素本身的環(huán)境危害更大。抗生素的大量使用，使水環(huán)境不僅成為耐藥基因的儲庫，也成為耐藥基因擴(kuò)展和演化的媒介，因此需要特別加強水環(huán)境中抗生素抗性基因

2、的環(huán)境行為研究。目前國內(nèi)對于ARGs的危害性還未給予應(yīng)有的重視，有關(guān)ARGs的研究大多集中于臨床微生物中抗性基因的定性分析方面，很少見到環(huán)境介質(zhì)中ARGs定性及定量分析的報道。有鑒于此，加強環(huán)境中抗生素抗性基因污染及傳遞機制等方面的研究，從而尋找有效措施阻止ARGs的產(chǎn)生及其在環(huán)境中的廣泛傳播是一項十分緊迫的任務(wù)。 本論文的目的是建立環(huán)境中抗生素耐藥性檢測及抗生素抗性基因(ARGs)的存在和含量水平分析的方法，初步調(diào)查珠三角水環(huán)

3、境中細(xì)菌耐藥性現(xiàn)狀及ARGs的存在和含量水平。主要研究內(nèi)容包括：1)使用抗生素抗性培養(yǎng)基篩選的方法調(diào)查北江水域四環(huán)素、紅霉素及磺胺類抗生素耐藥性細(xì)菌的存在；2)使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)以及基因測序的方法來探測幾種四環(huán)素、紅霉素及磺胺類ARGs的存在；同時，3)采用熒光定量PCR對sull和sul2這兩種磺胺類抗性基因進(jìn)行進(jìn)一步定量分析，以獲得其污染水平。 本研究選取了具有代表性的9個采樣點來調(diào)查珠三角水環(huán)境中細(xì)菌耐藥性現(xiàn)狀及抗

4、性基因的存在和含量水平。具體研究結(jié)果如下： 1.采用抗生素抗性培養(yǎng)基篩選法，研究了珠三角水環(huán)境中細(xì)菌對四環(huán)素、紅霉素及磺胺類抗生素的耐藥性情況。抗性培養(yǎng)基的終濃度分別為，四環(huán)素，50mg/L；紅霉素，18 mg/L；磺胺二甲嘧啶，280 mg/L。在所研究的9個水樣中，8個水樣對磺胺二甲嘧啶有耐藥性，5個水樣對四環(huán)素有耐藥性，7個水樣對紅霉素有耐藥性；而所有對照實驗結(jié)果均為陰性。這些實驗結(jié)果表明，該方法可用于水環(huán)境中細(xì)菌耐藥性檢

5、測，所獲得的樣品耐藥性結(jié)果表明該研究水域細(xì)菌耐藥性情況比較嚴(yán)重。 2.使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法深入研究了幾種四環(huán)素、紅霉素及磺胺類等三類不同類別抗生素抗性基因的存在。經(jīng)定性PCR實驗證實其中5個樣品含有磺胺類抗性基因sull，4個樣品含有磺胺類抗性基因sul2。 3.對PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測序，以進(jìn)一步確定是否為目的基因?；驕y序結(jié)果進(jìn)一步證實4個樣品含有sull目的基因，2個樣品含有sul2目的基因。所有基因測序均

6、通過正反鏈測序證實，測序結(jié)果與目的基因的匹配度在98～100％范圍內(nèi)，同時，作為熒光定量PCR內(nèi)參的16S-rRNA基因亦經(jīng)克隆測序證實。故可以十分肯定地表明水樣中存在磺胺類抗性基因的污染。 4.國內(nèi)首次采用熒光定量PCR方法對sul1和sul2兩種磺胺類抗性基因進(jìn)行了定量分析，獲得了北江一些水樣ARGs的污染水平。定量PCR結(jié)果顯示，7個樣品中sul1和sul2均有檢出。sul1與16S-rRNA表達(dá)量的比值在0.002729