青藏高原水環(huán)境中H5N1亞型流感病毒的分離鑒定及其遺傳演化分析.pdf

1、2005年5—7月,我國青海湖及周邊區(qū)域首次出現(xiàn)大量候鳥死于H5N1型高致病性禽流感。由于部分候鳥具有在水環(huán)境中生活的習性,所以水體成為禽流感病毒重要的高危載體。為了了解青藏高原禽流感發(fā)生及傳播模式,本研究建立了一種硝酸纖維素膜過濾的方法檢測水環(huán)境中的禽流感病毒,應用此方法從青海湖周邊水環(huán)境樣品中分離出一株高致病性H5N1亞型流感病毒,并對其致病性、生物學特性、遺傳變異等進行了研究。從而為揭示流感病毒引起的病理學變化規(guī)律及其傳播機制提供

2、科學依據。
　　 用硝酸纖維素膜過濾法對自來水和生活污水中的禽流感病毒進行濃縮,回收率分別為96.14％和93.44％,二者無顯著差異。實驗中對禽流感病毒做10倍系列稀釋再回收,回收率隨病毒濃度變化不明顯,應用本方法均可以有效起到回收病毒的作用。在自來水中,當病毒的投放濃度達96PFU/L以上時,回收率均在78.13％以上。在污水中,當投放濃度達到96PFU/L時,回收率為47.92％,比自來水中的回收率有所下降。本試驗比較了甘

3、氨酸緩沖液、牛肉膏溶液、磷酸緩沖液3種最為常用的洗脫液在不同pH條件下(7、9.5、11)的最佳洗脫效果。試驗結果表明,當pH9.5,0.1mol/L甘氨酸緩沖液作為洗脫液時的病毒回收率最高。用本方法對青海地區(qū)水樣品進行分離濃縮,結果分離出一株高致病性H5N1流感病毒。
　　 從致病性試驗可知,此分離株流感病毒感染鴨只后24h,在鴨的肺、腎、肝、脾、腦和胸肌中可檢測到病毒。感染后36h時機體內病毒含毒最高；到60h時機體含毒量下

4、降,在肝、脾、腎檢測不到病毒的存在,而在肺、腦、胸肌病毒含量仍基本維持峰值,小鼠感染流感病毒后變化趨勢和鴨只感染后的變化趨勢幾乎一致,唯一不同的是在感染后60h在肌肉中檢測不到流感病毒,說明流感病毒具有組織嗜性。
　　 用無特定病原體(SPF)雞胚增殖病毒,提取雞胚尿囊液中的病毒總RNA,設計禽流感病毒的8個基因的引物,通過反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術分別擴增分離株的8個基因片段的全序列cDNA,將其分別克隆在PM

5、D18-T載體上進行鑒定和序列測定。結果表明擴增的8個基因片段均包含H5N1流感病毒相應的完整開放閱讀框架。用DNAStar分析軟件對本分離株與11株禽流感病毒的基因組的8個基因序列進行分子遺傳演化分析,結果表明本分離株的HA基因與歐亞種系分離株Shandong/2003同源性為98.6％,且在同一進化分支上；而與北美代表株Ireland/1983同源性為86％,且在相距較遠的進化分支上,此比較結果表明本分離株起源于歐亞種系。本分離株H