人H5N1流感病毒DNA疫苗的構(gòu)建及其功能研究.pdf

1、本文以我國首株分離到的人H5N1亞型流感病毒的血凝素(HA)基因為模板，構(gòu)建了針對人禽流感的DNA疫苗。選用的真核表達載體pStar具有一個內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)，在其上下游分別存在一個多克隆位點(MCS)，能夠同時表達兩個目的蛋白。設(shè)計相應(yīng)的引物以保留HA前端的信號肽序列并去除末端的跨膜區(qū)，將可溶性HA和HA1基因片段分別克隆至上游的多克隆位點，同時將人白細胞介素2(IL-2)基因克隆至下游的多克隆位點。將構(gòu)建成功的真核表達質(zhì)

2、粒經(jīng)肌肉注射免疫小鼠，檢測小鼠的體液免疫反應(yīng)和細胞免疫反應(yīng)。 全文主要內(nèi)容包括： 一，人H5N1流感病毒DNA疫苗的構(gòu)建和鑒定。 二，人H5N1流感病毒DNA疫苗在真核細胞中的表達和檢測。 三，人H5N1流感病毒DNA疫苗的免疫效果評價。 主要的研究結(jié)果如下： 1．人H5N1流感病毒DNA疫苗的構(gòu)建和鑒定本室構(gòu)建的pCR-BluntⅡ-TOPO-HA含有我國首株分離到的人H5N1亞型流感病

3、毒的HA全長基因，我們以此作為模板應(yīng)用PCR技術(shù)擴增得到可溶性HA(1593bp)和可溶性HA1(1032bp)基因片段。將其分別克隆至載體pGEM-T Easy，用Xho Ⅰ和Mlu Ⅰ雙酶切鑒定，挑選正確的克隆進行測序。將測序正確的pGEM-T Easy-HA和pGEM-T Easy-HA1質(zhì)粒經(jīng)Xho Ⅰ和Mlu Ⅰ雙酶切后電泳回收HA和HA1片段，然后將其插到真核表達載體pStar上游的多克隆位點。 此外，我們以含有人I

4、L-2基因的質(zhì)粒pCD-IL2作為模板應(yīng)用PCR技術(shù)擴增得到人IL-2(465bp)基因片段。將PCR產(chǎn)物直接用BamH Ⅰ和NotⅠ雙酶切，電泳回收IL-2片段并插到pStar下游的多克隆位點，酶切鑒定并挑選正確的克隆進行測序。由此，共構(gòu)建了pStar-HA、pStar-HA-IL2、pStar-HA1、pStar-HA1-IL2和pStar-IL2五種真核表達質(zhì)粒。 2．人H5N1流感病毒DNA疫苗在真核細胞中的表達和檢測為

5、檢測我們構(gòu)建的DNA疫苗在真核細胞中能否正常轉(zhuǎn)錄和翻譯，選用真核細胞COS7和293T進行質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染和表達。 1) 可溶性HA和HA1蛋白在293T細胞中的表達和檢測應(yīng)用脂質(zhì)體法將質(zhì)粒pStar-HA、pStar-HA1和pStar分別轉(zhuǎn)染293T細胞，48小時后收獲細胞培養(yǎng)上清并用三氯醋酸進行濃縮。將濃縮的上清進行12％的SDS-PAGE電泳和Western blot檢測。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pStar-HA的細胞上清在85k

6、D附近有特異性條帶，轉(zhuǎn)染pStar-HA1的細胞上清在50kD附近有特異性條帶，分別與HA和HA1蛋白的預(yù)期大小相符，而轉(zhuǎn)染pStar的細胞上清中未見特異性條帶。表明可溶性HA和HA1蛋白在293T細胞中成功地表達。 2) 可溶性HA和HA1蛋白在COS7細胞中的表達和檢測應(yīng)用脂質(zhì)體法將質(zhì)粒pStar-HA、pStar-HA1和pStar分別轉(zhuǎn)染COS7細胞，24小時后用冷甲醇固定細胞，應(yīng)用間接免疫熒光法檢測HA和HA1蛋白的表

7、達。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pStar-HA、pStar-HA1的細胞孔有明顯的黃綠色熒光，而轉(zhuǎn)染pStar的細胞孔未見特異性黃綠色熒光。表明可溶性HA和HA1蛋白在COS7細胞中成功地表達。 3)IL-2蛋白在293T細胞中的表達和檢測應(yīng)用脂質(zhì)體法將質(zhì)粒pStar-HA-IL2，pStar-HA1-IL2、pStar-IL2和pStaur分別轉(zhuǎn)染293T細胞，72小時后收獲細胞培養(yǎng)上清，應(yīng)用MTT法檢測細胞上清中IL-2的生物學活性

8、。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細胞上清中檢測到了IL-2的活性，而在轉(zhuǎn)染pStar的細胞上清中沒有檢測到其活性，表明IL-2蛋白在293T細胞中成功地表達。 3.人H5N1流感病毒DNA疫苗的免疫效果評價大量制備重組質(zhì)粒DNA，經(jīng)肌肉注射免疫4～6周齡雌性BALB/c小鼠。將小鼠隨機分為6組，每組5只，免疫劑量為100μg/只。共免疫4次，間隔18天。采集免疫小鼠的外周血和脾細胞，分別用于檢測體液免疫反應(yīng)和細胞免疫反應(yīng)。

9、1) 免疫小鼠體液免疫反應(yīng)的檢測應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)和紅細胞凝集抑制實驗分別測定小鼠血清中HA特異性IgG抗體的滴度和血凝抑制抗體(HI)的滴度。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pStar-HA、pStar-HA-IL2、pStar-HA1、pStar-HA1-IL2免疫組小鼠血清中的特異性IgG抗體滴度在免疫后逐漸升高，且具有抑制流感病毒凝集紅細胞的能力，與對照組間存在顯著性差異。說明重組質(zhì)粒成功地在動物體內(nèi)誘導(dǎo)了體液免疫反應(yīng)。

10、 2) 免疫小鼠細胞免疫反應(yīng)的檢測應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT)檢測小鼠脾細胞分泌IFN-γ的能力，以評價DNA疫苗誘導(dǎo)細胞免疫反應(yīng)的能力。將免疫小鼠的脾細胞用培養(yǎng)基調(diào)整至所需的細胞濃度，分別用合成的HA短肽和刀豆蛋白A(ConA)作為刺激物刺激24小時，最后通過計數(shù)斑點來判斷細胞免疫反應(yīng)的水平。從conA刺激的實驗數(shù)據(jù)可以看出，重組質(zhì)粒免疫組的斑點數(shù)目明顯高于空載體對照組，說明DNA疫苗能夠激活小鼠的細胞免疫反應(yīng)。 綜