貂源H9N2亞型流感病毒的分離鑒定和血清學(xué)調(diào)查及其傳播特性研究.pdf

1、H9N2亞型流感病毒可引起人以及各種動物低致病性呼吸道疾病。水貂對其易感，由于我國水貂養(yǎng)殖特點為狐貍、貉子與其混合飼養(yǎng)，從而加大了狐貍、貉子感染H9N2亞型流感病毒的機(jī)會。
　　為研究H9N2流感病毒在水貂群中的流行及進(jìn)化情況，以及是否在狐貍和貉子種群中造成感染。2015年本實驗室從山東省中東部地區(qū)收集到105份水貂、32份狐貍和20份貉子的肺組織,并從水貂肺組織中分離到六株 H9N2亞型流感病毒，A/Mink/Shandong/

2、Z1/2015,A/Mink/Shandong/Z2/2015,A/Mink/Shandong/Z3/2015,A/Mink/Shandong/Z4/2015,A/Mink/Shandong/Z5/2015和A/Mink/Shandong/Z6/2015。而在狐貍和貉子的肺組織中沒有分離到流感病毒。
　　將六株分離毒株的核苷酸序列與GenBank中收錄的H9N2亞型流感病毒的核苷酸序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，該六株分離毒株的八個基因片段同源

3、性為99.2％～100％；其PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因與A/mink/Shangdong/F10/2013(H9N2)(Mk/SD/F10/13)毒株的相應(yīng)片段同源性最高，都在97.0％以上，而PB2基因與A/environment/Suzhou/14/2013(H7N9)同源性最高，為99.4%。
　　為進(jìn)一步揭示六株分離毒株的分子特征，用DNASTAR軟件分別推導(dǎo)其各基因片段的氨基酸序列，并與參考毒株進(jìn)行比較

4、分析。分析結(jié)果表明，該六株分離毒株八段氨基酸序列的同源性為98.2-100%。六株分離毒株的HA蛋白第226位氨基酸均為亮氨酸(Leu)，具有SAα-2,6-Gal的受體結(jié)合特性；其裂解位點處氨基酸序列為RSSR，表明六株病毒均是低致病性的毒株；HA蛋白有8個潛在糖基化位點，與參考毒株相比，在218位氨基酸處丟失了一個潛在的糖基化位點，在313位氨基酸處增加了一個潛在的糖基化位點；六株分離毒株P(guān)B2蛋白的氨基酸序列在627位編碼谷氨酸G

5、lu，第701位編碼天冬酰胺 Asn，第627位符合禽源流感的特點，但第701位的天冬酰胺 Asn可以補(bǔ)償?shù)?27位突變產(chǎn)生的影響，增強(qiáng)其在哺乳動物體內(nèi)的復(fù)制能力。
　　為了進(jìn)一步分析六株分離毒株的基因片段的起源，用GeneBank中的H9N2亞型流感病毒的序列作為參考序列，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析。HA基因的系統(tǒng)發(fā)生樹分析得出：六株分離毒株屬于歐亞Ⅲ系的Y280亞系分支, NA基因與內(nèi)部基因PB1、PA、NP、NS的系統(tǒng)發(fā)生樹分析表明：

6、六株分離毒株屬于歐亞Ⅱ系的Shanghai/F/98亞系分支，M基因的系統(tǒng)發(fā)生樹表明：六株分離毒株屬歐亞Ⅱ系的Hong Kong/G1/97亞系分支。且以上7個片段與Mk/SD/F10/13毒株具有最近的親緣關(guān)系；PB2基因的系統(tǒng)發(fā)生樹分析表明：六株分離毒株屬于歐亞Ⅰ系的Korea/38349-p96323/96亞系分支，且與A/environment/Suzhou/14/2013(H7N9)有很近的親緣關(guān)系。
　　為研究貂源H9

7、N2亞型流感病毒能否在水貂種群中水平傳播，是否可以跨種傳播給狐貍、貉子。本研究用實驗室保存的Mk/SD/F10/13毒株進(jìn)行動物實驗。動物實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在接種后的第4-8天，哨兵水貂出現(xiàn)了精神沉郁、食欲減退、流清亮鼻涕、流眼淚、輕微的咳嗽等癥狀，最后攻毒水貂和哨兵水貂都恢復(fù)健康，沒有造成死亡。排毒檢測發(fā)現(xiàn)哨兵水貂在第4～6天內(nèi)能夠通過鼻腔向外界排毒。剖檢能發(fā)現(xiàn)肺臟出血、氣管環(huán)出血、脾臟腫大出血等病理學(xué)變化。組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)肺臟表現(xiàn)出血

8、性間質(zhì)性肺炎，且肺泡壁充血增厚。第14天采集水貂血液樣本分離血清進(jìn)行HI抗體檢測發(fā)現(xiàn)HI抗體均為陽性。哨兵狐貍和貉子沒有表現(xiàn)臨床癥狀，也沒檢測到排毒，但第14天采集狐貍和貉子血清檢測發(fā)現(xiàn)HI抗體均為陽性。同時進(jìn)行了狐貍和貉子的致病性實驗，攻毒狐貍和貉子沒有表現(xiàn)臨床癥狀，也沒檢測到排毒，而第14天采集狐貍和貉子血清檢測發(fā)現(xiàn)HI抗體也為陽性。這些結(jié)果表明：在實驗條件下，貂源H9N2亞型流感病毒可以在水貂種群中水平傳播，并可以跨種傳播給狐貍、

9、貉子。此外，為進(jìn)一步研究H9N2亞型流感病毒在水貂、狐貍和貉子種群中的流行情況，進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查。調(diào)查結(jié)果：水貂血清中抗H9N2亞型流感病毒的抗體陽性率達(dá)為31%（97/313），高于2013年的20%。狐貍血清中抗H9N2亞型流感病毒的抗體陽性率為59.4%（76/128），貉子血清中抗H9N2亞型流感病毒的抗體陽性率為41.4%（106/256）。該結(jié)果表明H9N2亞型流感病毒在水貂群中的流行越來越廣泛，并在狐貍和貉子群中流行。