骨骼肌組織生物力學和生物化學時序性變化推斷死亡時間的研究.pdf

1、背景與目的：
　　死亡時間(time of death)也稱死后間隔時間(Postmortem Interval,PMI)系指尸檢時距個體死亡時的時間間隔。準確地推斷PMI，對于尋找案件偵查線索、鎖定偵查范圍、確定/排除犯罪嫌疑人和案件性質，重現作案過程及審判等方面均有重要證據價值。因此，準確推斷PMI歷來是法科學研究與法醫(yī)鑒定實踐中重要課題之一，也是法醫(yī)學的歷史性難題。
　　生物力學已在醫(yī)學領域得到了廣泛應用，形成了前景廣

2、闊的醫(yī)學生物力學。代謝組學是繼基因組學和蛋白質組學之后的新近學科，定量地探討病變組織診斷和療效的代謝標志物?；谑w組織“回歸自然”的進行性自溶腐敗和風化的死后變化，必然存在時序性生物化學物質降解及其相應生物力學性狀變化的原理，利用生物力學和代謝組學的理論和技術，本課題組前期研究了空氣中和水中大鼠不同PMI的尸體軟組織生物力學性狀時序性變化、不同年齡和性別軟組織生物力學性狀變化，以及放血處死家豬肝、小腸、主動脈、皮膚等組織生物力學和生物

3、化學性狀時序性變化規(guī)律，證實了組織生物力學性狀、生物化學指標與PMI之間存在明顯的相關性。
　　本研究系在這些前期研究基礎上，探討甲醛和酒精固定的不同PMI骨骼肌的組織生物力學性狀，及其固定-萃取液中生物化學物質成分含量變化規(guī)律，結合骨骼肌組織大體形態(tài)、顯微組織結構和計算機病理圖像處理等技術，量化分析骨骼肌組織生物力學性狀和生物化學物質變化與組織形態(tài)結構的構效關系，及其多種量化指標分別地和組合地推斷PMI的科學性和可行性。

4、　　材料與方法：
　　1實驗動物組織來源
　　體重120-150 kg成年家豬的骨骼肌組織（里脊肉）組織10批次，保濕儲運。實驗室內按生物力學和生物化學實驗需求，處理后分別放入廣口瓶或離心管等特定容器，置于恒溫25℃/恒濕100％人工氣候箱內。以家豬死后5 h為第一時間點，記為0 h。
　　2組織形態(tài)學觀測
　?、琶块g隔12 h觀測大體變化并記錄各時間點家豬肌肉塊色澤、質地、形態(tài)、腐敗程度、氣味等指標變化情況。應

5、用數碼相機和Photoshop CS5.0軟件讀取各時間點骨骼肌組織照片顏色的RGB值。
　?、圃?-138 h間，每隔12 h，取骨骼肌組織檢材，分別平行和垂直肌肉纖維方向切取，常規(guī)制作組織石蠟切片，分別HE和P-VB特殊染色方法染色，使用Leica Application Suite Version4.0.0圖像分析系統(tǒng)，觀測記錄各時間點骨骼肌組織形態(tài)結構的時序性變化情況。采用Image-Pro Plus6.0病理圖像量化分析

6、系統(tǒng)，量化分析骨骼肌組織鏡下肌纖維密度、直徑、面積以及光密度等指標。
　　3取材規(guī)范
　　采用“六定”取材規(guī)范：
　?、哦〞r：生物力學實驗組分別于死后0-132 h時間段內每隔12 h取材，共12個時間點組。生物化學實驗分別于死后0-192 h時間段內每隔12 h取材，共18個時間點組；
　?、贫ㄎ缓投ㄏ颍喝〖邑i脊柱肌的背側肌組部位骨骼肌組織(里脊肉)，平行和垂直肌肉纖維方向切取立方體組織塊；
　?、嵌ㄒ汉?/p>

7、定比：按常規(guī)蒸餾水與分析純甲醛原液按9:1配制4%甲醛溶液，常規(guī)蒸餾水與分析純乙醇原液按2:8配置80%乙醇溶液。生物力學試件和生物化學檢材均按檢材與固定液溶劑質量-體積比1:10固定，固定時間為72 h；
　?、榷ㄐ危荷锪W試件預取2×2×2 cm3檢材，固定后平整切取1×1×1 cm3正方體試件，生理鹽水沖洗和紗布保濕。生物化學組以質量為準切相應大小立方體狀組織。
　　4生物力學檢測
　　每時間組3-6個試件，分

8、甲醛固定和乙醇固定兩組，采用便攜式生物力學檢測儀(KDI-0.2,凱強利)，沿肌纖維縱向壓縮試件，自動監(jiān)測記錄：力-變形曲線、應力-應變曲線、極限載荷、平均力、斷裂力、彈性模量、屈服應力、屈服應變等力學指標。
　　5生物化學檢測
　　各時間點骨骼肌組織固定72 h后，單層快速定性濾紙過濾（Φ12.5 cm，沃華），分別取甲醛和乙醇的固定-萃取液作為生物化學檢材：
　?、庞^察拍照記錄各時間點固定-萃取液大體顏色變化；

9、r>　?、芃P220型pH計測定固定-萃取液的酸堿度；
　?、遣捎勉t鈷比色法測定固定-萃取液的色度；
　　⑷茚三酮染色法，紫外-可見分光光度計（TU-1901，普析通用）全波段掃描，分析固定-萃取液中α-氨基類物質濃度變化。
　　6統(tǒng)計分析
　　采用SPSS16.0、GraphPad Prism5.0和Excel2007等統(tǒng)計軟件對所得數據進行分析，各組數值以均數±標準差((x)±s)表示，采用獨立樣本t檢驗、單

10、向方差分析(One-way ANONA)，相關回歸分析和多元回歸分析，統(tǒng)計學檢驗的定義P<0.05為差別具有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差別具有高度統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1大體形態(tài)改變
　　新鮮骨骼肌組織色澤隨時間逐漸變化，呈半透明狀紅色有光澤-暗紅色無光澤-斑片狀黃色區(qū)-大片金黃色；肌纖維紋理逐漸模糊消失；質地由柔韌富彈性逐漸軟化。48 h開始出現斑點狀液化，逐漸擴大成片狀液化區(qū)，再逐步整體泥化、液化。72-1

11、68 h疏松膨脹，180 h后完全液化，呈稀糊狀。36 h開始發(fā)臭，逐漸加強，84 h時臭味最著，再逐漸減弱，114 h后臭味不明顯。
　　36-120 h的R、G、RGB三者均值隨PMI延長呈增大趨勢(p<0.05)，120 h后變化趨勢不明顯(p>0.05)；B值36小時后變化趨勢不明顯。因此，骨骼肌顏色變化推斷PMI的窗口期為36-120 h，各顏色值與PMI相關回歸方程分別為：PMI=0.884R+75.211， R2=0

12、.9683，PMI=0.8368G+44.383，R2=0.9641；PMI=0.657RGB+55.972，R2=0.9486。多元回歸分析：窗口期為36-120 h，PMI=0.872G-0.589R-0.364B+21.728，R2=0.862。0-36 h各時間點骨骼肌顏色R、G、B、RGB四通道均值，隨PMI延長呈減小趨勢，曲線擬合無意義（均p>0.05）。
　　2組織形態(tài)學及病理圖像量化分析
　　HE和P-VB特

13、殊染色觀察，隨著PMI延長，肌細胞逐漸腫脹、斷裂、碎裂、溶解、融合；間質結締組織膠原纖維逐漸腫脹、不規(guī)則斷裂、溶解。48 h前，肌纖維間隙較大，之后肌間隙逐漸縮小、纖維逐漸融合；96 h后，肌纖維大片融合；86 h后HE和P-VB染色不均。觀測各時間點肌纖維面積、平均密度、平均直徑、累計光密度。其中縱切面的P-VB染色四個指標變化均呈明顯的時序性變化規(guī)律，密度窗口期為36-96 h；肌肉纖維面積、直徑、累計光密度變化趨勢基本一致，窗口期

14、為72-120 h，均與PMI高度相關性（P<0.01）。相關方程為：PMI=0.66X密度-4.312，R2=0.881；PMI=0.236X直徑+4.809， R2=0.853；PMI=1.984×10-3X面積+64.126；R2=0.8527；PMI=（1.146E-6） XIOD+6.310， R2=0.8789。橫切面兩種染色和縱切面HE染色的四種指標均無明顯規(guī)律。
　　3生物力學性狀檢測
　　各時間點試件的極限

15、載荷（最大力）、平均力、彈性模量三個組織生物力學性狀參數較穩(wěn)定，符合總體方差齊性。乙醇和甲醛固定的肌組織生物力學性狀隨PMI變化趨勢相同，但乙醇固定的參數值略大，窗口期內各指標與PMI相關性顯著均P<0.05。
　　4生物化學檢測
　?、烹SPMI延長，骨骼肌組織的固定-萃取液顏色逐漸加深，呈無色透明-淡黃色-深黃色漸變。鉻鈷比色法測定固定-萃取液的色度值：①乙醇固定-萃取液色度推斷PMI窗口期為12-120 h，間隔36 h

16、組間差異P﹤0.05，PMI=0.32Chroma+1.808，R2=0.826。②甲醛固定-萃取液色度推斷 PMI的窗口期為12-108 h，間隔48 h組間差異 P﹤0.05， PMI=0.28Chroma+1.908，R2=0.895。
　?、埔掖脊潭?萃取液PH值呈無前平臺期的上升趨勢，推斷PMI窗口期為0-84 h，之后變化無規(guī)律，PMI=4.037PH-23.212，R2=0.922。
　　甲醛固定-萃取液PH均

17、值隨PMI延長，呈先上升后下降趨勢，推斷PMI上升窗口期12-48 h和下降窗口期60-120 h。上升窗口期：PMI=3.312PH-11.70，R2=0.837；下降窗口期：PMI=38.061-6.156PH，R2=0.870。
　?、擒崛旧墓潭?萃取液，Abs570nm呈單一穩(wěn)定吸收峰，隨PMI吸光度逐漸增加，呈時序性上升趨勢。①乙醇固定-萃取液推斷PMI的窗口期為在48-132 h，間隔36h組間差異性P﹤0.05

18、，PMI=12.860Abs+5.607，R2=0.683。②甲醛固定-萃取液推斷PMI的窗口期為在72-156 h，間隔36h組間差異性P﹤0.05，PMI=12.219Abs+6.395，R2=0.839。
　　結論：
　　1、基于死后組織自溶腐敗的時序性變化，骨骼肌組織的單向進行性尸體生物化學降解變化，導致了尸體組織形態(tài)學的相應結構變化，構成了尸體組織生物力學變化的物質基礎，符合基本的物質理化構效關系原理，可作為綜合應

19、用生物力學和生物化學技術檢測相關的物質量變和質變的推斷PMI的理論依據。
　　2、常規(guī)甲醛和乙醇固定的骨骼肌，即時固化取材時PMI點的腐敗自溶，同時，還可提高組織生物力學性狀的時間差和延長其檢測時限，提高利用骨骼肌生物力學性狀推斷PMI的科學性和實用性。檢測極限載荷、平均力、彈性模量等生物力學相關指標時序性變化可用于推斷PMI?？傮w上，認為甲醛固定組生物力學推斷PMI優(yōu)于乙醇固定。
　　3、常規(guī)甲醛和乙醇固定骨骼肌，在即時終

20、止組織自溶腐敗的同時，還可兼具組織中死后生物化學變化產物的萃取液作用，檢測相關蛋白等生物大分子降解物的種類及其含量變化可以推斷PMI。總體上，認為乙醇固定組生物化學推斷PMI優(yōu)于甲醛固定。
　　4、兩種固定-萃取液的PH值、色度值，大體顏色的RGB值，骨骼肌組織形態(tài)體視學等觀測指標，也可用于推斷PMI，均有各自不同的推斷PMI窗口期和優(yōu)勢。
　　本項目證實了綜合進行常規(guī)固定后骨骼肌組織生物力學性狀和生物化學指標以及組織形態(tài)的