1、目的：
孕激素M受體(progesterone receptor mitochondrial，PR-M)是近些年發(fā)現(xiàn)的存在于線粒體外膜的一種新型孕激素受體，其獨(dú)特線粒體定位特征決定其功能，研究發(fā)現(xiàn)孕激素可以通過孕激素M受體上調(diào)線粒體膜電位促進(jìn)子宮平滑肌細(xì)胞的異常增殖。我們前期研究發(fā)現(xiàn)孕激素M受體在子宮平滑肌瘤與正常瘤旁組織相比，肌瘤組織中孕激素M受體明顯高表達(dá)。通過劑量依賴的形式誘導(dǎo)原代培養(yǎng)和永生化子宮平滑肌細(xì)胞線粒體膜電位的
2、增加，證明PR-M受體使細(xì)胞能量代謝增加、增值的非基因組作用。但具體作用機(jī)制尚未完全明確。本研究提出的假說是:孕激素通過PR-M上調(diào)促凋亡蛋白Caspase3及抑制抗凋亡蛋白Bcl-2，促進(jìn)肌瘤細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，從而參與子宮平滑肌瘤的發(fā)生發(fā)展，這種作用可以被孕激素受體拮抗劑所抑制。
子宮肌瘤是女性生殖道腫瘤中發(fā)生的最常見的類型，并從單一的肌層平滑肌細(xì)胞克隆性增殖的發(fā)展，最初由細(xì)胞的遺傳變化引起的。在復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如
3、激素、生長因子等因素的改變，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)，(WNT)/β-連環(huán)蛋白，視黃酸(RA)為子宮肌瘤的發(fā)展的重要作用。此外，這些信號因子可能通過共同的因素調(diào)節(jié)，如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和蛋白kinase B（也稱為Akt）的多個途徑。增進(jìn)腫瘤成長的首要原因包含遺傳、激素、免疫和環(huán)境等原因。目前，除了外科手術(shù)如子宮切除術(shù)、子宮肌瘤剔除術(shù)、子宮動脈栓塞(UAE)和磁共振成像引導(dǎo)聚焦超聲手術(shù)(MRgFUS)，子宮肌瘤聚焦在緩解癥
4、狀，減慢或阻止腫瘤發(fā)展的藥物的策略。治療三類主要用于減輕癥狀，抑制肌瘤細(xì)胞增殖，即非甾體類抗炎藥(NSAIDs)、促性腺激素釋放激素激動劑(GnRHa)和拮抗孕激素活性合成類固醇，包括米非司酮和所有。作為一種治療策略，外科手術(shù)與手術(shù)死亡率和發(fā)病率有關(guān)，藥物治療也因其副作用而受到限制。促性腺激素釋放激素激動劑可以減輕出血和大量相關(guān)的癥狀，但也可能造成重大的更年期的副作用。米非司酮(Mifepristone，MIF)被稱為婦科藥物的中流砥柱
5、。作為孕激素拮抗劑和其他激素治療改變雌激素和孕激素的生產(chǎn)或功能可能會影響生育能力。MIF可縮小肌瘤體積，安全、有效、經(jīng)濟(jì)的子宮肌瘤的術(shù)前輔助藥物。
通過手術(shù)中收集患者子宮平滑肌瘤手術(shù)標(biāo)本提煉原代培養(yǎng)的細(xì)胞作為基礎(chǔ)，使用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行平滑肌細(xì)胞鑒定，使用免疫蛋白印跡法作用于原代培養(yǎng)細(xì)胞株篩選表達(dá)孕激素M受體陽性并孕激素A/B陰性的細(xì)胞株，使用MIF干預(yù)在不同時(shí)間、不同濃度梯度的濃度后，通過使用MTT比色法與流式細(xì)胞法檢測陽性
6、實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組組原代培養(yǎng)肌瘤增殖與凋亡的相關(guān)研究。使用Western blot檢測Caspase3和Bcl-2的表達(dá)水平。探討與對于指導(dǎo)臨床孕激素的合理應(yīng)用有重要意義，同時(shí)為肌瘤的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)，甚至開辟新的治療思路，具有廣闊的社會和經(jīng)濟(jì)應(yīng)用前景。
方法：
1、研究對象
于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科住院病人中隨機(jī)選擇2016年8月至2017年1月中因單純子宮肌瘤行開腹子宮肌瘤挖除術(shù)的患者10例，年
7、齡32～47歲，平均(41±3.36)歲。術(shù)前至少6個月內(nèi)未使用類固醇激素，同時(shí)沒有合并性激素相關(guān)疾病。標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)，手術(shù)中肌瘤細(xì)胞的采集均經(jīng)患者知情同意，并通過鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會審核。術(shù)中無菌條件下切除2-3塊1立方厘米的平滑肌瘤組織，放入4℃含雙抗的DMEM試管內(nèi)，置入冷藏箱到細(xì)胞間處理，用無菌培養(yǎng)皿浸泡于PBS液3-5min，使用高壓滅菌眼科剪將肌瘤組織剪碎。
2、試驗(yàn)方法
(1)培養(yǎng)皿中細(xì)胞培
8、養(yǎng)24h貼壁后進(jìn)行第一次換液，以后2-3天左右進(jìn)行一次換液，當(dāng)培養(yǎng)皿中細(xì)胞融合后用配好的試劑胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。利用顯微鏡高倍鏡下觀察培養(yǎng)瓶中細(xì)胞形態(tài)。并經(jīng)免疫組化確定子宮平滑肌瘤細(xì)胞。
(2)首先使用蛋白免疫印跡法分別測出高表達(dá)孕激素受體M、孕激素受體A和孕激素受體B的的細(xì)胞株，從中篩選出PR-M陽性細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)組，PR-M（-）陰性細(xì)胞株作為對照組，陽性對照T47D乳腺癌細(xì)胞株是同時(shí)表達(dá)孕激素受體M、A、B細(xì)胞特異性抗
9、體。
(3)實(shí)驗(yàn)分為高濃度組、中濃度組、低濃度組、對照組，其中孕激素受體拮抗劑(MIF)濃度分別為10-4，10-5，10-6mol/L，空白對照。處理時(shí)，對照組加入相同劑量的培養(yǎng)基。
(4)通過MTT法分別檢測孕激素受體M陽性組與陰性組高濃度組、中濃度組、低濃度組和空白組細(xì)胞增殖抑制率，每孔90μl，每組6個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，按上述分組加藥處理，培養(yǎng)48小時(shí)后在96孔板內(nèi)加入20μl混合液，在450nm酶標(biāo)儀下測
10、吸光度，重復(fù)三次。增殖抑制率=(對照組0D450nm-實(shí)驗(yàn)組0D450nm)/(對照組0D450nm-空白組0D450nm)×100％。
(5)通過取對數(shù)生長期的子宮肌瘤細(xì)胞，在6孔板內(nèi)以1.0×105/孔培養(yǎng)，根據(jù)高、中、低濃度組和對照組加入不同濃度孕激素受體拮抗劑，培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞于15ml的離心管，加入4℃預(yù)冷的PBS緩沖液。將離心管置于離心機(jī)內(nèi)，設(shè)置轉(zhuǎn)速為800rpm，離心5min，取出后小心吸去上清液，加入10
11、0μl的Binding Buffer重懸細(xì)胞，1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
(6)Western blot檢測按照MIF濃度分為高、中、低濃度組和對照組干預(yù)后，孕激素M受體陽性組隨著MIF濃度增加凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)逐漸降低，凋亡促進(jìn)蛋白Caspase3的表達(dá)逐漸增強(qiáng)。其中與對照蛋白表達(dá)量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
結(jié)果：
1.實(shí)驗(yàn)為了增加原代細(xì)胞培養(yǎng)成功率及細(xì)胞數(shù)量，通過縮短標(biāo)本
12、運(yùn)輸時(shí)間和及時(shí)清洗肌瘤細(xì)胞，成功建立了9例子宮肌瘤體外細(xì)胞模型。倒置相差顯微鏡細(xì)胞形態(tài)觀察:細(xì)胞接種培養(yǎng)1天后，觀察貼壁狀況，隨后肌瘤細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則生長。7天左右細(xì)胞數(shù)量達(dá)高峰，并出現(xiàn)層疊排列及典型的“峰一谷”，通過免疫組化實(shí)驗(yàn)確定該細(xì)胞是子宮平滑肌瘤細(xì)胞。（圖1-2）。
2.蛋白免疫印跡法于子宮肌瘤細(xì)胞中選出PR-M陽性細(xì)胞株(PR-M(+)/PR-A/B（-））作為實(shí)驗(yàn)組，PR-M（-）陰性細(xì)胞株（PR-M（-）/PR
13、-A/B(+))作為對照組。
3.MIF作用于兩組細(xì)胞干擾48h后，PR-M陽性高濃度組、中濃度組、低濃度組和空白組細(xì)胞增殖抑制率分別為(29.28±3.04)％、(22.71±3.46)％、(9.32±2.27)％和(3.16±0.53)％，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。PR-M陰性中高濃度組、中濃度組、低濃度組和空白組細(xì)胞增殖抑制率分別為(38.33±3.47)％、(33.42±4.15)％、(14.44±2.
14、01)％和(4.14±0.65)％,各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。PR-M陽性細(xì)胞增值抑制率小于PR-M陰性細(xì)胞增值抑制率，相同濃度組之間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
4.MIF作用于兩組細(xì)胞干擾48h后，PR-M陽性高濃度組、中濃度組、低濃度組和空白組細(xì)胞凋亡率分別為(44.63±4.69)％、(35.15±5.02)％、(18.74±2.45)％和(6.31±0.84)％，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意
15、義(P＜0.05)。PR-M陰性中高濃度組、中濃度組、低濃度組和空白組細(xì)胞凋亡率分別為(63.44±6.84)％、(51.37±6.45)％、(25.61±3.14)％和(7.73±1.04)％，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。當(dāng)MIF中濃度＞1×10-6mol/L，PR-M陽性細(xì)胞凋亡率小于PR-M陰性細(xì)胞凋亡率，相同濃度組之間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
5.PR-M陽性組各組間Caspase3和
16、Bcl-2蛋白表達(dá)量結(jié)果顯示，促凋亡蛋白Caspase3表達(dá)量隨著MIF濃度增高，蛋白表達(dá)量逐漸增大。抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量隨著MIF作用濃度的增高，蛋白表達(dá)量逐漸降低。其中不同濃度各組間蛋白表達(dá)量與空白對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
結(jié)論：
1.子宮肌瘤的生長可能通過PR-M受體抑制細(xì)胞凋亡，起到促進(jìn)細(xì)胞增值，而這種作用可能被孕激素受體抑制劑所抑制。
2.PR-M通過調(diào)節(jié)增殖與凋亡參
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