基于可視陣列傳感對(duì)細(xì)胞代謝過程的研究.pdf

1、細(xì)胞代謝產(chǎn)物與細(xì)胞生命活動(dòng)過程密切相關(guān)，可以準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞生理病理狀態(tài)。與基因或者蛋白質(zhì)相比，細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量傳遞等細(xì)胞內(nèi)生命過程多發(fā)生在代謝層面，通過細(xì)胞代謝產(chǎn)物進(jìn)行調(diào)控。對(duì)細(xì)胞代謝產(chǎn)物中的生物分子定性定量檢測(cè)，并尋找細(xì)胞微量代謝物與生理病理變化的對(duì)應(yīng)關(guān)系，對(duì)于醫(yī)學(xué)診斷具有相當(dāng)重要的作用。目前，在生物分子及生物體系狀態(tài)的檢測(cè)中常用的方法是大型儀器檢測(cè)，大型儀器雖然保證了檢測(cè)的準(zhǔn)確率，卻帶來了高額的檢測(cè)費(fèi)用和低下的檢測(cè)效率；電子鼻/

2、舌等新興技術(shù)雖然在構(gòu)建原理和加工制備等方面已較為完善，但是由于敏感材料的選擇性和穩(wěn)定性問題也無法廣泛應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)中。本研究立足于開發(fā)一種新型可視陣列傳感器系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子及生物體系狀態(tài)的快速檢測(cè)。
　　 可視化傳感陣列是通過模擬哺乳動(dòng)物味覺/嗅覺識(shí)別過程，將多種具有一定特異性和敏感性的廣譜識(shí)別材料作為敏感單元，以目標(biāo)混合物作為獨(dú)立樣本進(jìn)行分析，獲取其特征指紋，并利用模式識(shí)別算法實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的特異性識(shí)別與鑒定，在混合物檢

3、測(cè)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。其中，卟啉及其衍生物因其良好的生物相容性和光敏性能成為彩色可視傳感器研究熱點(diǎn)之一，以其作為傳感元件具有靈敏度高，穩(wěn)定性好，易于修飾改性等特點(diǎn)。本研究以卟啉及其衍生物作為敏感材料構(gòu)建彩色可視化傳感陣列，并應(yīng)用這種陣列傳感器、對(duì)氨基酸、蛋白質(zhì)及細(xì)胞代謝產(chǎn)物的檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)正常細(xì)胞和病理細(xì)胞代謝周期的特異性檢測(cè)，有望為藥物的體外篩選提供有效平臺(tái)。所完成的主要工作和結(jié)論如下：
　　 1.完成了卟啉可視陣列傳感器系

4、統(tǒng)材料的合成與篩選
　　 以氨基酸為檢測(cè)對(duì)象，采用Adler法設(shè)計(jì)并合成了水溶性磺酸基取代卟啉衍生物(PS1和PS4)以及卟啉金屬衍生物(P1-P5)。通過分析卟啉、卟啉衍生物及指示劑染料與十種氨基酸反應(yīng)后紫外可見光譜變化，說明卟啉及其衍生物和指示劑染料可以與氨基酸結(jié)合程度不同，對(duì)氨基酸具有一定的親和力和選擇性，產(chǎn)生可用于分析的模式信號(hào)。并用類似方法篩選得到一個(gè)含有36個(gè)敏感單元的彩色可視檢測(cè)陣列，通過各個(gè)傳感受體的交叉響應(yīng)，用

5、于生物分子的檢測(cè)。
　　 2.完成了卟啉可視陣列傳感器系統(tǒng)的構(gòu)建工作
　　 詳細(xì)闡述了卟啉可視陣列傳感器系統(tǒng)構(gòu)建的設(shè)計(jì)方案及檢測(cè)方法，對(duì)卟啉可視陣列傳感器系統(tǒng)進(jìn)行了硬件設(shè)計(jì)、軟件設(shè)計(jì)及傳感芯片設(shè)計(jì)。通過硬件設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了傳感芯片反應(yīng)前后的圖像采集，通過軟件設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)前后芯片圖像的處理、可視化指紋響應(yīng)差譜圖的輸出和數(shù)據(jù)的保存。并利用溶膠凝膠法，按照TEOS：水：鹽酸：乙醇：染料(卟啉、卟啉衍生物及pH指示劑)體積比為25:

6、4:3:15:10的比例制備溶膠凝膠溶液，通過毛細(xì)管點(diǎn)樣構(gòu)建了一種6×6的傳感陣列，得到了一種對(duì)生物分子和生物體系具有識(shí)別能力和廣譜識(shí)別效果的傳感芯片，為人工舌檢測(cè)系統(tǒng)的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。
　　 3.應(yīng)用構(gòu)建的卟啉可視陣列傳感器系統(tǒng)開展了對(duì)生命活動(dòng)中重要生物分子氨基酸、糖類化合物和蛋白質(zhì)的檢測(cè)研究
　　 氨基酸、糖類化合物和蛋白質(zhì)是構(gòu)成生命體的基本物質(zhì)，是細(xì)胞代謝的基礎(chǔ)物質(zhì)。利用所構(gòu)建的可視化陣列傳感系統(tǒng)，對(duì)十種常見的氨基酸

7、、九種糖類化合物及其混合物以及七種蛋白質(zhì)及混合物和三種熱變性蛋白進(jìn)行了檢測(cè)，獲得了其特異性指紋圖譜。結(jié)合紫外可見光譜和密度泛函理論，從理論分析和化學(xué)計(jì)算角度分析了卟啉PS1與氨基酸間相互作用機(jī)理，表明氨基酸的殘基結(jié)構(gòu)是影響其與卟啉分子間相互作用的關(guān)鍵。采用聚類分析(HCA)、主成分分析(PCA)以及判別分析(LDA)等模式識(shí)別方法對(duì)彩色陣列的RGB分析結(jié)果顯示。分析結(jié)果顯示，本文構(gòu)建的可視陣列傳感器系統(tǒng)能夠顯著的區(qū)別不同的氨基酸，并且反

8、映出不同氨基酸之間的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)差異；通過對(duì)糖類化合物及其混合物以及蛋白質(zhì)及其混合體系以及變性蛋白的檢測(cè)，結(jié)果表明，可視傳感陣列可以顯示出出幾類糖類化學(xué)我和蛋白之間在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的真實(shí)差異。
　　 4.應(yīng)用傳感陣列檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)周期的鑒別
　　 利用可視化卟啉傳感陣列對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)培養(yǎng)1-10d的細(xì)胞代謝液進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)采用聚類分析和主成分分析(PCA)進(jìn)行了計(jì)算和分析，并結(jié)合MT

9、T比色法和紫外可見光譜法對(duì)陣列與細(xì)胞代謝的響應(yīng)進(jìn)行了驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過陣列響應(yīng)的可視差圖可以對(duì)HUVEC培養(yǎng)1-10d的細(xì)胞代謝液進(jìn)行顯著區(qū)別。聚類分析、主成分分析和判別分析結(jié)果表明，彩色可視傳感陣列能較好的區(qū)分人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞不同培養(yǎng)時(shí)間下的生長(zhǎng)代謝差異，并具有較好的重復(fù)性和可重現(xiàn)性。另外，將陣列指紋圖譜的歐氏距離與紫外可見光譜的峰值點(diǎn)進(jìn)行綜合分析，表明所構(gòu)建的可視陣列傳感系統(tǒng)在檢測(cè)過程中能夠有效捕捉細(xì)胞代謝過程中代謝物的特征，

10、在細(xì)胞識(shí)別、探究細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律、細(xì)胞研究和藥物篩選等領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　 5.基于微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)正?；ず筒±砘ぜ?xì)胞的識(shí)別與檢測(cè)
　　 介紹了微流控芯片的制備加工過程，考察了該體系對(duì)細(xì)胞分離和培養(yǎng)的效果，并利用可視化傳感器陣列檢測(cè)了正?；ぜ?xì)胞(NHS)和關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞(RA)培養(yǎng)1-9天的代謝液的變化。HCA和PCA分析的結(jié)果表明彩色可視傳感陣列可以有效辨別不同培養(yǎng)時(shí)間下的細(xì)胞生長(zhǎng)代謝差異。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)1-