GATA轉(zhuǎn)錄因子對(duì)心肌能量代謝及細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 心臟具有生成ATP的巨大潛能以滿足對(duì)能量的高度需求。在胚胎時(shí)期及心肌肥大發(fā)生時(shí),心臟主要依賴葡萄糖和乳糖作為底物產(chǎn)生ATP,而在出生后及成人心臟則主要依賴脂肪酸作為底物產(chǎn)生ATP而獲得能量。由于心肌的脂質(zhì)和葡萄糖儲(chǔ)存能力有限,因此,它們作為底物的選擇及ATP的生成是受到快速調(diào)節(jié)的,以迅速適應(yīng)心臟的能量需求。
　　 這一調(diào)節(jié)過(guò)程涉及到多種基因不同時(shí)間的先后表達(dá)和相互作用,它們形成一個(gè)有序的網(wǎng)絡(luò)。該調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)包括

2、大量的,在時(shí)間和空間上極為精確的一系列分子事件。在這個(gè)過(guò)程中,哪怕是極微小的錯(cuò)誤都將導(dǎo)致心肌能量代謝障礙的發(fā)生,而心肌能量代謝障礙,如線粒體脂肪酸氧化活性的降低,造成ATP產(chǎn)量減少,將會(huì)導(dǎo)致心泵功能、收縮功能及鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)功能等失調(diào),從而誘發(fā)心肌肥大和心力衰竭等。因此,深入研究心肌能量代謝關(guān)鍵基因的調(diào)控機(jī)制,將有助于從分子水平闡明心血管疾病的分子機(jī)理和病理學(xué)基礎(chǔ),同時(shí)也可為心血管疾病的臨床防治和新藥設(shè)計(jì)提供更多線索。
　　 那么

3、,涉及心肌能量代謝的關(guān)鍵基因有什么呢?Glut4是調(diào)節(jié)心肌能量代謝的一個(gè)基因,它是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員,維持著機(jī)體葡萄糖的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡。Glut4的表達(dá)具有組織特異性并受到激素調(diào)節(jié),Glut4基因敲除小鼠出現(xiàn)心肌肥大癥狀。因此,Glut4是調(diào)節(jié)心肌能量代謝的關(guān)鍵基因之一。鑒于此,Glut4作為心肌能量代謝的關(guān)鍵基因,其表達(dá)的降低或上調(diào),對(duì)于心肌能量代謝的調(diào)節(jié)具有重要的生理或病理意義,所以研究其調(diào)控機(jī)制,是心血管分子生物學(xué)領(lǐng)域的重要課題

4、。
　　 那么,參與心肌能量代謝的轉(zhuǎn)錄因子有哪些呢?過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome prolifcrator activated receptors,PPARs)是調(diào)節(jié)編碼脂肪酸β-氧化相關(guān)酶類基因的重要轉(zhuǎn)錄因子,它包含三種異形體:PPARα、PPARγ和PPARδ/β。這三種異形體都在心臟中表達(dá),與PPARγ相比,PPARα和PPARδ/β在心肌細(xì)胞中的表達(dá)更為豐富。研究表明,心臟特異性過(guò)表達(dá)PPARα將誘導(dǎo)

5、與脂肪酸利用有關(guān)的基因表達(dá),進(jìn)而增強(qiáng)心臟脂肪酸的利用和氧化:PPARδ/β基因敲除小鼠嚴(yán)重地?fù)p害心肌脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá),增加心臟脂肪酸堆積,從而誘發(fā)脂毒性。因此,PPARs在調(diào)節(jié)心肌能量代謝中發(fā)揮著重要作用。
　　 GATA蛋白是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子,因其識(shí)別序列(A/T)GATA(A/G)而得名。在該家族6個(gè)成員中,GATA4和GATA6是近年來(lái)心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。大量的研究證明GATA4和GATA6是調(diào)控心臟發(fā)育以

6、及心肌細(xì)胞增殖、分化和凋亡的重要轉(zhuǎn)錄因子。但它們是否在心肌能量代謝中發(fā)揮調(diào)控作用,目前知之甚少。
　　 MicroRNAs(miRNAs)是進(jìn)化上高度保守的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA,通過(guò)轉(zhuǎn)錄后機(jī)制調(diào)控靶基因的表達(dá)。近年來(lái)的研究表明miRNAs是心臟基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)重要組成部分,但miRNAs是否作用于GATA蛋白與PPARs,進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的表型產(chǎn)生影響,目前還鮮有報(bào)道。
　　 因此,本課題以GATA轉(zhuǎn)錄因子為中心,采

7、用多種方法深入研究了GATA6、PPARα、miR-200b以及GATA4對(duì)心肌能量代謝和細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制。
　　 研究方法與結(jié)果:
　　 第一部分:轉(zhuǎn)錄因子GATA6招募PPARα協(xié)同激活Glut4基因的表達(dá)
　　 為進(jìn)一步了解GATA家族對(duì)心肌能量代謝的調(diào)控作用,采用了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、Q-PCR、熒光素酶報(bào)告基因、Western Blot、CoIP、GST pull-down和ChIP等實(shí)驗(yàn)方法,證實(shí)了在PPAR

8、α激動(dòng)劑fenofibrate刺激的心肌細(xì)胞中,轉(zhuǎn)錄因子GATA6能夠招募核受體PPARα至葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glut4啟動(dòng)子的GATA元件上,這種招募能夠進(jìn)一步激活Glut4基因的表達(dá),并且伴隨著線粒體功能的促進(jìn)及葡萄糖利用的增加。
　　 Western Blot及Q-PCR實(shí)驗(yàn)顯示GATA6或PPARα及其激動(dòng)劑fcnofibrate都能夠刺激Glut4基因的表達(dá),若二者共表達(dá)則可以產(chǎn)生更強(qiáng)烈的激活效應(yīng),說(shuō)明GATA6和PPAR

9、α協(xié)同激活Glut4基因轉(zhuǎn)錄。CoIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)GATA6和PPARα相互作用。GST pull-down實(shí)驗(yàn)顯示GATA6的C端鋅指和PPARα的N端鋅指介導(dǎo)二者間的相互作用。ChIP及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證實(shí)GATA6通過(guò)與PPARa蛋白的N端 TAD和鋅指結(jié)構(gòu)域相互作用,招募PPARα至Glut4啟動(dòng)子從而協(xié)同激活Glut4基因的表達(dá),促進(jìn)線粒體的功能及葡萄糖的利用。
　　 該部分的研究證實(shí)了轉(zhuǎn)錄因子GATA6是心肌能

10、量代謝的重要調(diào)節(jié)因子,核受體PPARα是GATA6調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中新的相互作用因子,這為理解GATA6在心臟發(fā)育和心臟疾病的作用機(jī)制提供了新的分子基礎(chǔ)。
　　 第二部分:fenofibrate和Dox對(duì)小鼠NADH氧化酶及檸檬酸脫氫酶活性的影響
　　 多柔比星(doxorubicin,Dox)是一種常用的抗腫瘤藥物,由于它的嚴(yán)重毒性大大限制了它的臨床使用。線粒體功能障礙是其潛在的致毒機(jī)制之一,但具體機(jī)制未知。由于在第一

11、部分研究中觀察到PPARα對(duì)細(xì)胞線粒體功能具有保護(hù)作用,所以我們進(jìn)一步研究了PPARα激動(dòng)劑fenofibrate在體內(nèi)能否保護(hù)線粒體功能并逆轉(zhuǎn)Dox的毒性。
　　 將8周大的小鼠隨機(jī)分為四組并給予不同的處理:對(duì)照組:每天0.5％羧甲基纖維素鈉灌胃一次,連續(xù)14天;fenofibrate處理組:每天fenofibrate(100mg/kg)灌胃一次,連續(xù)14天;Dox處理組:第12、13和14天,每天腹腔注射Dox(15mg/k

12、g)一次;聯(lián)合組:同時(shí)接受fenofibrate和Dox處理。14天后處死小鼠,分離提取心室、心房、肝臟、腎臟、肺和脾臟組織的線粒體,檢測(cè)線粒體功能的標(biāo)志酶檸檬酸合酶及NADH氧化酶活性。結(jié)果顯示:fenofibrate可在多個(gè)組織中保護(hù)線粒體功能,相反,Dox則在多數(shù)組織中抑制線粒體的功能,而且,fenofibrate在心室和腎臟中能夠逆轉(zhuǎn)Dox的毒性。
　　 這一研究證實(shí)fenofibrate對(duì)線粒體檸檬酸合酶和NADH氧化

13、酶具有保護(hù)作用,并且在心室和腎臟中能夠逆轉(zhuǎn)Dox的毒性作用,為臨床上如何減輕Dox的化療副作用提供了理論依據(jù)。
　　 第三部分:miR-200b作用于GATA4對(duì)細(xì)胞增殖、周期和凋亡的調(diào)控
　　 為了尋找GATA家族的上游調(diào)控分子,經(jīng)生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)GATA4可能是miR-200b的靶基因。miR-200b參與調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程,是腫瘤細(xì)胞形成的重要調(diào)控因子。由于miRNAs調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多個(gè)

14、生理學(xué)和病理學(xué)過(guò)程,因此,我們采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、RNAi、熒光素酶報(bào)告基因、MTT、流式細(xì)胞術(shù)、DAPI染色RT-qPCR等實(shí)驗(yàn)方法研究了miR-200b對(duì)細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響。
　　 結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)GATA4和miR-200b分別促進(jìn)和抑制C2C12及P19細(xì)胞的增殖。而且,過(guò)表達(dá)miR-200b及siRNA抑制GATA4表達(dá)均誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯,S期和G2/M期細(xì)胞百分比降低。DAPI染色證實(shí)miR-200b過(guò)

15、表達(dá)還能誘導(dǎo)細(xì)胞核發(fā)生凋亡。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明miR-200b可與GATA43’非翻譯區(qū)(3'-UTR)特異性結(jié)合。Western Blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-200b可以在蛋白水平上抑制GATA4的表達(dá),表明GATA4確系miR-200b的靶基因。
　　 該研究證實(shí)了GATA4是miR-200b的靶基因,miR-200b通過(guò)轉(zhuǎn)錄后機(jī)制調(diào)控GATA4的蛋白表達(dá),進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖,致使細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯,并誘導(dǎo)細(xì)

16、胞發(fā)生凋亡。這些結(jié)果表明miR-200b可能通過(guò)靶向GATA4在心臟發(fā)育、增殖與凋亡等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
　　 結(jié)論:
　　 1、在PPARα激動(dòng)劑fenofibrate刺激的心肌細(xì)胞中,轉(zhuǎn)錄因子GATA6招募核受體PPARα至葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glut4啟動(dòng)子的GATA元件上,這種招募能夠進(jìn)一步激活Glut4的表達(dá),并且伴隨著線粒體功能的促進(jìn)及葡萄糖利用的增加。
　　 2、PPARα激動(dòng)劑fenofibrat

17、e對(duì)線粒體檸檬酸合酶和NADH氧化酶具有保護(hù)作用,可減輕抗癌藥物Dox誘導(dǎo)的心、腎毒性。3、miR-200b作用于轉(zhuǎn)錄因子GATA4,抑制C2C12細(xì)胞和P19細(xì)胞的增殖,致使細(xì)胞發(fā)生G1/G0期阻滯并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 本研究證實(shí)了GATA6是心肌能量代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要組成成分,并且作為PPARα的輔助激活因子協(xié)同PPARα調(diào)控心肌能量代謝。這為理解GATA6在心臟發(fā)育和心臟疾病的作用機(jī)制提供了新的分子基礎(chǔ)。這一研究還揭示