重要蔬菜種傳檢疫性病害檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、本論文簡(jiǎn)單介紹了植物種傳病害的定義、分類已及其相關(guān)檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展情況。真菌性種傳病害的檢測(cè)方法主要包括洗滌鏡檢、保濕培養(yǎng)、致病性測(cè)定和PCR等方法，植物病毒性病害的檢測(cè)方法主要有癥狀觀察(包括鑒別寄主反應(yīng))、血清學(xué)反應(yīng)、分子生物學(xué)方法等。本論文以黃瓜綠斑駁花葉病毒、煙草環(huán)斑病毒和黃瓜黑星病菌為例，著重研究植物種傳病毒病害和植物種傳真菌病害的檢測(cè)和研究方法，并對(duì)種傳病害的檢測(cè)方法作了簡(jiǎn)單總結(jié)。
　　 黃瓜綠斑駁病毒是典型的種傳病毒

2、，本研究以接種黃瓜綠斑駁病毒的帶毒黃瓜種子作為材料，建立了快速檢測(cè)黃瓜綠斑駁病毒的多種方法，包括DAS-ELISA法、普通RT-PCR法、熒光RT-PCR法、免疫捕獲RT-PCR法和免疫磁珠RT-PCR法，并對(duì)各種檢測(cè)方法的靈敏度進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，各種的PCR方法的靈敏度都比DAS-ELISA方法的靈敏度高，其中實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的靈敏度最高，可檢測(cè)到2ng黃瓜種子中的黃瓜綠斑駁花葉病毒。普通RT-PCR最低可檢測(cè)到200ng黃瓜

3、種子中的黃瓜綠斑駁花葉病毒，而免疫捕獲RT-PCR(IC-RT-PCR)的靈敏度是普通RT-PCR的2倍。免疫磁珠RT-PCR(IMS-RT-PCR)檢測(cè)時(shí)，當(dāng)磁珠包被的單克隆抗體濃度為1.5×10-5mg/ml時(shí)，可檢測(cè)到的最低的抗原，濃度為7.813×10-3mg/ml，靈敏度是普通RT-PCR的4倍。
　　 煙草環(huán)斑病毒是豇豆花葉病毒科，可以通過種子進(jìn)行傳播，本研究通過設(shè)計(jì)TRSV外殼蛋白的特異性引物，利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的TR

4、SV毒源做為試驗(yàn)材料，建立了檢測(cè)TRSV的普通RT-PCR方法、免疫捕獲RT-PCR方法、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR(SYBRGreen法)的檢測(cè)方法，并且對(duì)各種檢測(cè)方法的靈敏度靈進(jìn)行了研究，確定了不同方法所能檢測(cè)到的病毒最低含量。
　　 黃瓜黑星病是重要的植物種傳真菌病害，是近年來(lái)黃瓜生產(chǎn)中的重要病害之一，對(duì)我國(guó)黃瓜以及其他葫蘆科蔬菜和果樹生產(chǎn)的造成巨大損失。本研究以黃瓜黑星的三個(gè)菌株：菌株-11279、菌株-38730和菌株-沈陽(yáng)

5、作為實(shí)驗(yàn)材料，用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行真菌的培養(yǎng)，在20℃的黑暗和光照兩種情況下進(jìn)行孢子萌發(fā)條件的研究，結(jié)果表明，在黑暗條件下孢子易萌發(fā)。再將三個(gè)菌株接種于健康黃瓜葉片上，待黃瓜成熟后取出黃瓜種子，在進(jìn)行一系列的PCR方法的研究。利用真菌通用引物ITS4/5進(jìn)行初步篩選，再用特異性引物HGHX-F1/R以及W-F/R和N-F/R進(jìn)行普通PCR和巢式PCR反應(yīng)，得出特異性DNA擴(kuò)增條帶和DNA序列。將病菌的孢子形態(tài)與病菌的DNA序列結(jié)果相結(jié)合，