誘導受體產(chǎn)生一氧化碳減輕小鼠移植心缺血再灌注損傷和排斥反應的機制研究.pdf

1、第一部分應用Tail-cuff技術(shù)改良小鼠頸部異位心臟移植模型
　　 目的：小鼠頸部心臟移植模型是研究移植缺血再灌注損傷和排斥反應的理想模型，由于顯微血管吻合的技術(shù)問題，限制了其在醫(yī)學研究中的廣泛應用。在本實驗室既往應用套管法(cuff technique)建立該模型的基礎(chǔ)上，本研究應用Tail-cuff技術(shù)(帶尾套管法)改良小鼠頸部異位心臟移植模型。
　　 方法：昆明小鼠用作預實驗，C57BL/6和BALB/c小鼠用作

2、正式試驗。應用24G和22G靜脈內(nèi)導管制作成帶有尾巴的動脈或靜脈套管(Tail-cuff)，在準備受體血管時，Tail-cuff通過右頸外靜脈或右頸總動脈近心端后，用顯微血管夾一起固定其近心端和Tail-cuff管的尾巴，翻轉(zhuǎn)血管并固定后分別與供心的肺動脈主干和升主動脈連接固定。
　　 結(jié)果：應用這種改良技術(shù)，預實驗手術(shù)成功率為72.2％(13/18)，總操作時間為56.2±8.9min。正式實驗總操作時間為49.6±7.4 m

3、in，血管翻轉(zhuǎn)和與供心連接時間分別為3.6±1.4min和4.1±1.1min，正式實驗(12例同系移植，24例同種移植)的成功率為100％(36/36)。
　　 結(jié)論：應用Tail-cuff技術(shù)建立小鼠頸部異位心臟移植模型顯示出一定的優(yōu)越性，是一種理想的方法。
　　 第二部分誘導受體產(chǎn)生一氧化碳減輕小鼠移植心的冷缺血再灌注損傷
　　 目的：一氧化碳(carbon monoxide, CO)是血紅素加氧酶催化亞鐵

4、血紅素生成的代謝產(chǎn)物之一，對大鼠肝、肺、腎和小腸的缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury, IRI)具有明顯的保護作用。本研究在小鼠心臟移植模型的基礎(chǔ)上，觀察以二氯甲烷(methylene chloride, MC)誘導受體小鼠產(chǎn)生CO對移植心冷IRI的影響，并探討其可能的機制。
　　 方法：以Balb/c小鼠作為供、受者，建立頸部異位心臟移植模型。實驗共分為4組，分別為MC100mg組(n=10

5、)、MC500mg組(n=12)、橄欖油組(IR組, n=10)和正常對照組(N, n=5)。前3組在麻醉前3 h分別用經(jīng)橄欖油稀釋的MC100mg/kg、MC500mg/kg以及單純橄欖油0.15 ml(IR組)對受者進行灌胃處理，然后行頸部異位心臟移植；N組小鼠僅作麻醉處理，不進行心臟移植。分別于灌胃后0、1、3、6、12和24 h剪尾采血，測定血液中CO的含量[用碳氧血紅蛋白(COHb)占總血紅蛋白的百分比表示]，并于相應時間點取

6、心肌組織，檢測心肌組織中CO的含量；各組移植后3h和24 h分別處死半數(shù)受者，檢測移植后3h和24 h血清中肌鈣蛋白I(cTnI)、心肌組織中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素10(IL-10)、細胞凋亡與相關(guān)基因Bcl-2和Bax mRNA 以及核因子κB(NF-κB)的表達，并觀察移植心心肌的超微結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果：與橄欖油灌胃比較，以MC100mg和 MC500mg灌胃受者血液中COHb濃度與心肌組織中CO含量明顯升

7、高，均在灌胃后3 h達到峰值(P<0.01)。與IR組比較，MC100mg和 MC500mg組受者心臟移植后3h和24 h，能顯著降低血清中cTnI水平(P<0.01)，并以MC500mg組降低最為明顯；可明顯下調(diào)促炎癥基因TNF-αmRNA水平(P<0.01)，而抗炎癥基因IL-10mRNA上調(diào)不明顯(P>0.05)，同時可以顯著上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2 mRNA水平(P<0.01)，并抑制促凋亡基因Bax mRNA的轉(zhuǎn)錄(P<0.0

8、1)；心肌超微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，以MC500mg組最為顯著。正常對照組可見少量NF-κB表達，而IR組、MC100mg組和MC500mg組NF-κB活性均顯著增強(P<0.01)，但后三組之間在相同時間點的NF-κB活性無明顯區(qū)別(P>0.05)。
　　 結(jié)論：誘導受體小鼠產(chǎn)生CO明顯減輕小鼠移植心冷IRI，其主要機理與CO的抗炎和抗凋亡作用有關(guān)，且不受NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)節(jié)。
　　 第三部分誘導受體產(chǎn)生一氧化碳經(jīng)

9、PI3K/Akt信號途徑抑制冷缺血再灌注誘導的移植心細胞凋亡
　　 目的：CO是體內(nèi)的一種重要信號分子。外源性低濃度的CO具有緩解血管損傷、排斥反應和急性肺損傷等功能，但涉及到的信號機理尚未完全闡明。本研究在小鼠心臟移植的基礎(chǔ)上，觀察誘導受體產(chǎn)生CO對移植心冷IRI中細胞凋亡的影響，并探討其可能的信號機制。
　　 方法：以Balb/c小鼠建立同系移植心冷IRI模型。受體用二氯甲烷(MC, 500mg/kg體重)灌胃誘導受

10、體小鼠產(chǎn)生CO(MC組, n=12)，或用橄欖油灌胃(IR組, n=12)，在MC組的基礎(chǔ)上受體在移植心恢復血供前1h腹腔注射PI3K抑制劑LY294002(40mg/kg, LY組, n=10)或二甲亞砜(DMSO組, n=10)；檢測移植后3h和24h(每一時間點n=5～6/組)移植心細胞凋亡并計算凋亡指數(shù)(AI)、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白、Bcl-2與Bax蛋白的表達及Caspase-3蛋白酶活性；設立正常對照組(N組, n

11、=5)。
　　 結(jié)果：受體以MC灌胃后血液中COHb濃度與心肌組織CO含量均在3h達到峰值，分別為(9.82±0.84)％和2.25±0.08 pmol/mg；與IR組比較，MC組明顯降低移植心AI [3h：(8.65±2.01)％vs.(19.28±4.94)％，P<0.01；24h：(5.82±2.36)％vs.(10.54±3.66)％，P<0.05]、激活Akt蛋白(3h：P<0.01；24h：P<0.05)、抑制Cas

12、pase-3蛋白酶活性(3h：2.19±0.18vs. 3.31±0.36, P<0.05)、上調(diào)Bcl-2/Bax比值(3h：1.97±0.16比0.46±0.07，P<0.01；24h：1.89±0.10比0.51±0.04，P<0.01)；而與MC組比較，LY組明顯增加AI[3h：(17.95±4.92)％，P<0.01；24h：(9.75±3.14)％；P<0.01]、抑制Akt蛋白激活(3h:P<0.01; 24：P<0.05

13、)、增強Caspase-3蛋白酶活性(3h：3.27±0.24, P<0.05)、下調(diào)Bcl-2/Bax比值(3h：0.47±0.06，P<0.01；24h：0.52±0.03，P<0.01)，從而逆轉(zhuǎn)其抗凋亡作用；DMSO組與MC組的各個指標無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論：誘導受體產(chǎn)生CO能明顯抑制冷缺血再灌注誘導的移植心的細胞凋亡，其機理可能與通過PI3K/Akt信號途徑對凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bc

14、l-2和Bax的調(diào)節(jié)有關(guān)。
　　 第四部分誘導受體產(chǎn)生一氧化碳減輕同種移植心排斥反應不依賴于Foxp3表達的上調(diào)
　　 目的：CO由于具有強大的干擾體內(nèi)氧運輸?shù)奶匦远ǔ１徽J為是一種有害的廢棄物。事實上，低濃度的CO通過調(diào)節(jié)血管張力、抗炎、抗凋亡等作用緩解移植物缺血再灌注損傷。本研究在小鼠心臟移植的基礎(chǔ)上，觀察誘導受體小鼠產(chǎn)生CO對同種移植排斥反應和移植心存活時間的影響，并探討其可能的機制。
　　 方法：建立小鼠

15、頸部異位心臟移植模型(C57BL/6→Balb/c小鼠)。受體小鼠自移植前1d至移植后第6d(MC1w組, n=11)或至第13d(MC2w組, n=10)以含二氯甲烷(MC)100mg/kg體重灌胃，或以同體積不含MC的橄欖油灌胃(Tx組, n=6)。觀測移植心存活時間，并于移植后6d、10d分別檢測受體血清TNF-α、IL-10的含量、心臟移植物和受體脾臟TNF-α、IL-10、Foxp3 mRNA及Foxp3蛋白的表達、心臟移植物

16、ICAM-1(細胞間粘附分子-1)及Caspase-3蛋白的表達；觀察移植后6d、10d或移植物心跳停止時移植心膠原纖維增生程度及組織病理學變化。
　　 結(jié)果：受體以MC灌胃后血液中COHb濃度在3h達到峰值，為 (5.24±0.45)％；受體誘導CO可以明顯延長移植心存活時間[Tx：(6.33±0.56)d; MC1w：(12.14±0.87)d, P<0.01vs.Tx; MC2w組：(19.38±0.95)d, P<0.0

17、1vs.Tx and MC1w]；降低血清TNF-α的含量(MC1w組：P<0.01vs.Tx; MC2w組：P<0.01vs.Tx and P<0.05vs. MC1w)；抑制心臟移植物和受體脾臟TNF-αmRNA的表達(MC1w組:P<0.01vs.Tx; MC2w組：P<0.01vs.Tx and MC1w)；抑制心臟移植物ICAM-1(MC1w組及MC2w組：P<0.01vs.Tx)及Caspase-3的表達(MC1w組:P<0

18、.01vs.Tx; MC2w組：P<0.01vs.Tx and MC1w)；減輕移植物內(nèi)膠原纖維增生及淋巴細胞和單核細胞侵潤的程度，以MC2w組最為明顯；各組血清IL-10含量、心臟移植物和受體脾臟IL-10mRNA、Foxp3 mRNA及Foxp3蛋白的表達無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論：受體小鼠誘導CO明顯減輕同種移植排斥反應并延長移植心的存活時間，其主要機制與可能與CO的抗炎癥和抗凋亡功能密切相關(guān)，而并不依賴于