基于生物條形碼末端延伸技術(shù)的電化學(xué)生物傳感器.pdf

1、基于腫瘤生物標(biāo)志物分子（如腫瘤相關(guān)DNA和蛋白質(zhì)）的診斷技術(shù)在腫瘤的早期診斷中具有重要意義，與常用的腫瘤診斷方法比可更早實(shí)現(xiàn)診斷。然而這些生物標(biāo)志物在臨床樣本中的含量極低，因此，開發(fā)靈敏度高和特異性強(qiáng)的檢測技術(shù)很有必要。電化學(xué)生物傳感器具有快速、高效、高靈敏度、構(gòu)造簡單、易于操作、便于小型化和規(guī)?；葍?yōu)點(diǎn)，具有早期快速診斷的潛力，因此備受關(guān)注。為提高生物標(biāo)志物的檢測靈敏度，本論文設(shè)計(jì)和研究了基于核酸末端延伸放大技術(shù)的電化學(xué)DNA傳感器和

2、適體傳感器。具體內(nèi)容如下:
　　一、基于核酸末端延伸放大的電化學(xué)DNA傳感器
　　構(gòu)建了納米生物條形碼，結(jié)合核酸末端延伸反應(yīng)和氧化還原酶對(duì)DNA檢測信號(hào)進(jìn)行放大，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)DNA的高靈敏度檢測。納米生物條形碼由金納米粒子和5'端巰基標(biāo)記信號(hào)探針組裝而成。當(dāng)目標(biāo)DNA存在時(shí)，組裝在金電極表面的3'端巰基標(biāo)記捕獲探針、目標(biāo)DNA和納米生物條形碼結(jié)合形成夾心結(jié)構(gòu)，然后在信號(hào)探針DNA的3'端以生物素標(biāo)記dATP為底物進(jìn)行末端延伸反

3、應(yīng)，延伸的長鏈上標(biāo)記的生物素可與親和素標(biāo)記辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)結(jié)合，通過檢測HRP催化底物產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào)可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA的高靈敏檢測。條件優(yōu)化后該傳感器檢測下限低于10fmol/L，檢測范圍達(dá)到9個(gè)數(shù)量級(jí)，具有較高靈敏度，能夠識(shí)別單個(gè)堿基錯(cuò)配，并且在血清模擬樣本中也有較高的檢出率。
　　為了更進(jìn)一步提高電化學(xué)DNA傳感器的性能，利用末端延伸酶構(gòu)建超分子DNA網(wǎng)，并以此實(shí)現(xiàn)了DN

4、A的高靈敏度檢測。組裝在金電極表面的捕獲探針捕獲目標(biāo)DNA后能提供3'末端，在末端延伸酶的催化作用下以生物素標(biāo)記dATP為底物進(jìn)行末端延伸反應(yīng)，然后將末端延伸的長鏈與支鏈DNA進(jìn)行雜交反應(yīng)并提供更多3'末端，交替進(jìn)行末端延伸和支鏈雜交過程，在多次循環(huán)結(jié)束后加入親和素標(biāo)記HRP，檢測HRP催化底物產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào)可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA的高靈敏檢測。所設(shè)計(jì)的超分子DNA網(wǎng)上布滿生物素，對(duì)DNA的檢測下限達(dá)到10fmol/L，在10fnol/L-

5、100pmol/L的檢測范圍內(nèi)呈線性，并且能夠識(shí)別單個(gè)堿基錯(cuò)配，具有較好的血清樣本檢出率。
　　二、基于核酸末端延伸放大的電化學(xué)適體傳感器
　　構(gòu)建了雙核酸適體夾心法的電化學(xué)適體傳感器，利用核酸末端延伸技術(shù)和氧化還原酶對(duì)癌胚抗原(Carcinoembryonic Antigen，CEA)檢測信號(hào)進(jìn)行放大。兩條核酸適體可同時(shí)與CEA結(jié)合形成夾心結(jié)構(gòu)，其中一條通過3'端巰基標(biāo)記組裝在金電極表面可特異性捕獲CEA，另一條為未修飾的

6、核酸適體信號(hào)探針;然后在核酸適體信號(hào)探針3'末端進(jìn)行延伸反應(yīng)，延伸出標(biāo)記多個(gè)生物素的長鏈與親和素標(biāo)記HRP結(jié)合，檢測HRP催化底物產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào)實(shí)現(xiàn)CEA的定量檢測。該傳感器對(duì)CEA分子的檢測下限低于10pg/mL，檢測范圍達(dá)到了6個(gè)數(shù)量級(jí)，并且具有較高的選擇性和血清模擬樣本檢出率。
　　在上述工作基礎(chǔ)上，構(gòu)建基于納米生物條形碼和核酸末端延伸技術(shù)的電化學(xué)適體傳感器，進(jìn)一步提高CEA的檢測靈敏度。5'端巰基標(biāo)記的核酸適體信號(hào)探針通