基于DNAzymes構(gòu)建電化學生物傳感器檢測生物小分子.pdf

1、生物傳感器是由生物、醫(yī)學、物理、化學、電子技術(shù)等多種學科相互滲透形成的新的研究領(lǐng)域。生物傳感器在臨床醫(yī)學、環(huán)境監(jiān)測和食品工業(yè)等方面都有重要應用，并以其體積小、特異性好、靈敏度高、檢測快速方便、檢測成本低和容易實現(xiàn)實時在線活體檢測等優(yōu)點，成為當前科學研究的熱點之一。近年來新的分子生物學技術(shù)不斷涌現(xiàn)，并在科學研究和實際應用中得到不斷的發(fā)展和完善，使生物分子檢測的靈敏度和特異性都得到很大的提高。然而隨著疾病診斷要求的不斷提高與科學研究的不斷深

2、入，迫切需要發(fā)展一些靈敏度高、選擇性好、操作簡單且成本低廉的生物傳感器以便更好地滿足科學研究和實際應用的需求。
　　本研究主要利用核酸酶(DNAzymes)的自剪切特性以及核酸切刻內(nèi)切酶N.BstNBⅠ的性質(zhì)來循環(huán)放大電化學檢測信號，從而提高新設(shè)計的生物傳感器的靈敏度;通過借助T4 DNA連接酶對其輔因子的高度依賴性以及核酸酶(DNAzymes)對其催化自剪切輔因子的特異性識別能力來提高新設(shè)計的生物傳感器的選擇性。
　　本研

3、究的主要內(nèi)容如下:
　　(1)基于酶連接反應和自剪切核酸酶信號放大雙重策略構(gòu)建新型電化學生物傳感器。討論了基于輔因子ATP依賴性的酶連接反應和自剪切核酸酶(8-17DNAzyme)信號放大雙重策略設(shè)計的電化學生物傳感器對于目標分子三磷酸腺苷(ATP)的檢測效果。連接反應生成的活性8-17 DNAzyme在Zn2+存在時，能夠剪切與其雜交的發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA基底，使標記了亞甲藍的基底片段離開金電極表面，從而產(chǎn)生可檢測的電化學信號。由于T

4、4 DNA連接酶對輔因子ATP具有高度的特異性，當檢測系統(tǒng)中不存在目標分子ATP時，兩段獨立的DNA片段不能被連接成一條完整的8-17 DNAzyme序列，后續(xù)的自剪切催化反應就不能發(fā)生。因此，此傳感器對ATP的響應具有高度的選擇性。連接反應產(chǎn)生的8-17 DNAzyme能夠循環(huán)放大自剪切所產(chǎn)生的電化學信號變化，增強傳感系統(tǒng)的靈敏度，使得此傳感器對于ATP的檢測限達到0.053 nM(S/N=3)。
　　(2)基于特異性DNAzy

5、me和核酸切刻內(nèi)切酶N.BstNBⅠ構(gòu)建新型電化學生物傳感器。主要討論了基于特異性DNAzyme和核酸切刻內(nèi)切酶N.BstNBⅠ信號放大雙重策略構(gòu)建的新型電化學生物傳感器對于目標分子L-組氨酸的檢測效果。當體系中存在目標分子L-組氨酸時，L-組氨酸依賴性的DNAzyme則在其腺嘌呤核糖核苷酸(rA)酶切位點發(fā)生相應的自剪切催化反應，導致DNAzyme在rA酶切位點處發(fā)生斷裂，因而游離出一段DNAzyme殘片與固定在金電極表面的HP-Fc

6、DNA發(fā)生雜交反應，在電極表面形成能被核酸切刻內(nèi)切酶N.BstNBⅠ特異性識別的DNA雙鏈。當體系中加入核酸切刻內(nèi)切酶N.BstNBⅠ時，在其特異性識別序列的酶切位點處就會發(fā)生催化剪切反應，使HP-Fc DNA發(fā)生斷裂，導致標記有二茂鐵的DNA碎片從電極表面游離出去，從而產(chǎn)生可檢測的電化學信號。由于此DNAzyme對其輔因子L-組氨酸具有高度的依賴性，所以此傳感系統(tǒng)對目標分子L-組氨酸的檢測具有超高的選擇性。核酸切刻內(nèi)切酶N.BstNB

7、Ⅰ參與的酶切反應過程能夠進行多圈循環(huán)，產(chǎn)生循環(huán)放大電化學檢測信號的效果，增強檢測系統(tǒng)的靈敏度，使得此傳感器對于L-組氨酸的檢測限達到360 nM(S/N=3)。
　　(3)基于DNAzyme、核酸切刻內(nèi)切酶N.BstNBⅠ、標記的短鏈DNA探針構(gòu)建signal-on型電化學生物傳感器。主要討論了基于特異性DNAzyme、核酸切刻內(nèi)切酶N.BstNBⅠ、亞甲藍標記的短鏈DNA探針構(gòu)建的signal-on型電化學生物傳感器對于目標分子

8、L-組氨酸的定量檢測效果。為了提高傳感器對于目標分子L組氨酸檢測的靈敏度，在同類型的signal-off傳感系統(tǒng)中加入亞甲藍標記的短鏈DNA探針，從而將其改進為一個新型的signal-on型電化學生物傳感器。改進后的傳感器對L組氨酸響應的線性范圍為5.0×10-7-1.0×10-3 M(線性相關(guān)系數(shù)為0.995)，檢測限達到0.21μM(S/N=3)。與之前報道的文獻相比，這個新型的signal-on型電化學生物傳感器在一定程度上提高了