代謝酶活性檢測(cè)熒光探針的設(shè)計(jì)、合成及應(yīng)用.pdf

1、代謝酶是機(jī)體防御和清除外來(lái)物質(zhì)入侵的重要生化屏障，同時(shí)在維系機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)代謝平衡中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直致力于開發(fā)特異性的代謝酶底物，以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體系中特定代謝酶的活性定量檢測(cè)和功能評(píng)估。相較于非熒光底物，熒光底物因其具有檢測(cè)靈敏、操作快捷、能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)和適合高通量篩選等優(yōu)勢(shì)而備受關(guān)注。但由于機(jī)體內(nèi)代謝酶種類繁多，部分代謝酶氨基酸序列相似性高，其底物譜多有重疊，所以目前鮮有特異性代謝酶熒光探針底物相關(guān)的報(bào)道。本文設(shè)

2、計(jì)、合成了檢測(cè)羧酸酯酶（亞型1和亞型2）、細(xì)胞色素P450酶（亞型1A1）和人血清白蛋白活性的具有高選擇性識(shí)別能力的熒光探針，為深入探究它們?cè)谏矬w系的功能以及臨床個(gè)性化用藥方面提供了工具。
　　(1)羧酸酯酶1作為人體內(nèi)一種重要的羧酸酯酶亞型，不僅能催化多種內(nèi)源性和外源性酯類分子的水解，并參與機(jī)體的多種生理和病理過程。從2-羥基苯并噁唑出發(fā)，設(shè)計(jì)、合成了一個(gè)檢測(cè)羧酸酯酶2活性的雙光子熒光探針BABO，該探針最低檢測(cè)限為0.04μ

3、g/mL，能夠檢測(cè)不同組織微粒體中羧酸酯酶1活性差異，對(duì)活細(xì)胞和肝組織切片中羧酸酯酶1進(jìn)行雙光子激發(fā)熒光成像。BABO適用于研究羧酸酯酶1代謝相關(guān)的藥物研發(fā)，探究其在生物體系中的分布和功能。
　　(2)羧酸酯酶2是人體內(nèi)另外一種重要的羧酸酯酶亞型，參與多種化療前體藥物的代謝活化。基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機(jī)理，利用2-二氰基亞甲基-3-氰基-4，5，5-三甲基-2，5-二氫呋喃衍生物為熒光團(tuán)，設(shè)計(jì)、合成了一個(gè)檢測(cè)羧酸酯酶2活性的長(zhǎng)波長(zhǎng)（λ

4、em=612 nm）熒光探針TCFB，單酶篩選以及抑制實(shí)驗(yàn)都表明TCFB具有極高的亞型選擇性，其良好的細(xì)胞透膜能力以及較低的細(xì)胞毒性和背景熒光使其適用于檢測(cè)活細(xì)胞中內(nèi)源性羧酸酯酶2。
　　基于激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移機(jī)理，從3-羥基黃酮熒光團(tuán)出發(fā)，設(shè)計(jì)、合成了一個(gè)熒光探針3-AF，首次實(shí)現(xiàn)了羧酸酯酶2活性的比率型信號(hào)檢測(cè)，減小系統(tǒng)誤差以及探針濃度分布不均等原因造成的影響。3-AF適用于復(fù)雜酶體系中羧酸酯酶2的檢測(cè)，為預(yù)測(cè)其介導(dǎo)的藥物分

5、子代謝消除的快慢，個(gè)性化用藥治療提供了依據(jù)。
　　(3)人血清白蛋白具有多種生理功能，其在血清中的含量可以作為許多疾病發(fā)生、發(fā)展的標(biāo)志物。從DDAO(1，3-二氯-7-羥基-9，9-二甲基-2(9H)-吖啶酮）熒光團(tuán)出發(fā)，基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機(jī)理設(shè)計(jì)、合成了一個(gè)檢測(cè)白蛋白活性的熒光底物DDAP，該探針基于白蛋白假酯酶活性設(shè)計(jì)而成，其代謝產(chǎn)物具有近紅外發(fā)射(λem=660 nm)，進(jìn)一步提高了信噪比，其最低檢測(cè)限為5.6 mg/L，D

6、DAP能檢測(cè)人血漿中白蛋白含量和人肝癌細(xì)胞分泌白蛋白能力。此外，作為反應(yīng)型探針，DDAP能夠區(qū)分熱致變性的白蛋白，而結(jié)合型探針無(wú)法區(qū)分，這對(duì)于檢測(cè)具有生理活性的白蛋白含量具有重要意義。
　　(4)細(xì)胞色素P4501A1是CYP1A亞家族的一員，在前致癌物和有毒物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮重要作用，同時(shí)也在一些藥物的代謝清除中扮演著重要角色。從試鹵靈熒光團(tuán)出發(fā)，基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機(jī)理開發(fā)了一個(gè)檢測(cè)CYP1A1活性的熒光底物CHPO，該探針