神經(jīng)粘附分子NB-3在高原腦水腫發(fā)生中的作用及機(jī)制.pdf

1、我國是世界上高原地區(qū)面積最大、邊境線最長(zhǎng)、定居人口最多的國家。高原地區(qū)環(huán)境特殊，其氧含量低、溫度低、濕度低、溫差大、紫外線輻射強(qiáng)。其中氧含量的下降對(duì)機(jī)體影響最為嚴(yán)重。腦是對(duì)缺氧最敏感的器官，對(duì)缺氧的耐受性也最差。當(dāng)氧的供應(yīng)不能滿足大腦需要時(shí)，腦的代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列變化，嚴(yán)重時(shí)甚至出現(xiàn)腦水腫等危及生命的病理改變。缺氧導(dǎo)致的腦損傷是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、多因素相互作用的、漸進(jìn)性的發(fā)展過程，涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、腦組織間質(zhì)水腫、細(xì)胞的水腫變

2、性和壞死等。高原低氧環(huán)境常伴隨胃腸功能的紊亂、炎癥以及感染風(fēng)險(xiǎn)的增加。研究發(fā)現(xiàn)在高原登山人群中，發(fā)生胃腸道或呼吸道感染等引發(fā)炎癥反應(yīng)的人群更容易患急性高山病，且其路易斯湖評(píng)分與炎癥嚴(yán)重情況成正相關(guān)。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)急性高山病患者血漿促炎細(xì)胞因子的表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào)。而炎癥在高原腦水腫發(fā)生中的作用尚缺乏研究。
　　血腦屏障是機(jī)體維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，由腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞的終足及血管外基膜構(gòu)成。相鄰的腦血管內(nèi)

3、皮細(xì)胞通過緊密連接蛋白緊緊的連接在一起，使血管中大小分子不能通過細(xì)胞旁路途徑進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)；腦血管內(nèi)皮細(xì)胞胞吞與胞飲的頻率極低，同時(shí)表達(dá)特異的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，從而限制了血管中大小分子通過跨細(xì)胞途徑進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。同時(shí)周細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞和血管外基膜通過多種分子通路與腦血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，參與血腦屏障形成及穩(wěn)定的調(diào)節(jié)。
　　細(xì)胞粘附分子在介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間粘附識(shí)別，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整和細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮了重要作

4、用。神經(jīng)粘附分子NB-3是細(xì)胞粘附分子免疫球蛋白超家族的成員。研究顯示NB-3通過親同性作用和親異性作用參與神經(jīng)干細(xì)胞的分化、神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)及導(dǎo)向、神經(jīng)元的存活與凋亡以及軸突再生的調(diào)節(jié)。同時(shí)NB-3在自閉癥、智力障礙、精神分裂癥、多動(dòng)癥、雙相障礙、厭食癥等精神疾病中發(fā)揮重要功能。實(shí)驗(yàn)室前期工作顯示NB-3敲除明顯加重小鼠腦缺血造成的損傷，同時(shí)NB-3敲除小鼠表現(xiàn)出對(duì)缺氧的不耐受。因此圍繞高原腦水腫的發(fā)生我們探討了NB-3在其中發(fā)揮的作

5、用及其可能調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　研究目的：
　　越來越多的實(shí)驗(yàn)研究及臨床調(diào)查提示炎癥反應(yīng)在急性高山病和高原肺水腫發(fā)生中的重要作用，炎癥反應(yīng)在高原腦水腫發(fā)生中的作用卻鮮有報(bào)道。因此我們首先研究了炎癥反應(yīng)在高原腦水腫發(fā)生中的作用。高原腦水腫發(fā)生的關(guān)鍵事件是血腦屏障的破壞。血腦屏障作為一個(gè)多細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用的細(xì)胞粘附分子可能發(fā)揮了重要作用。研究顯示NB-3在神經(jīng)系統(tǒng)損傷，尤其是缺氧性損傷中發(fā)揮了重要作用。因此我們?cè)u(píng)價(jià)了NB

6、-3在高原腦水腫發(fā)生中的作用，并探索了其發(fā)揮功能的可能機(jī)制。
　　研究?jī)?nèi)容：
　　本研究主要分為兩部分：一、基于炎癥反應(yīng)在急性高山病發(fā)生中的作用，我們討論了炎癥反應(yīng)在高原腦水腫發(fā)生中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制。二、基于上述小鼠高原腦水腫模型，使用NB-3敲除小鼠，我們進(jìn)一步探討了NB-3在高原腦水腫發(fā)生中的作用及其可能機(jī)制。具體研究思路如下圖所示：
　　高原低氧暴露加重LPS引起的炎癥反應(yīng)并促進(jìn)高原腦水腫的形成[此處為圖片略過]

7、
　　神經(jīng)粘附分子NB-3缺失加重高原腦水腫的進(jìn)展[此處為圖片略過]
　　研究方法：
　　采用干濕重法、MRI，我們?cè)u(píng)價(jià)了小鼠的腦含水量變化；通過檢測(cè)伊文斯蘭和IgG的漏出，我們?cè)u(píng)價(jià)了血腦屏障通透性的變化；通過Real-time PCR法，我們對(duì)小鼠腦組織中特定基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行檢測(cè)；通過ELISA法，我們對(duì)血清中的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)；通過免疫熒光法，我們對(duì)星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的激活進(jìn)行了評(píng)價(jià)，對(duì)NB-3在不同細(xì)胞的表達(dá)

8、定位進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)緊密連接蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位改變進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)血管的擴(kuò)張進(jìn)行評(píng)價(jià)；通過激光散斑成像技術(shù)，對(duì)小鼠頭部血流進(jìn)行檢測(cè)；通過Western blot法，對(duì)低氧相關(guān)蛋白、水腫發(fā)生相關(guān)蛋白、緊密連接蛋白等進(jìn)行檢測(cè)；通過透射電鏡，對(duì)小鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)；通過HE染色，Nissl染色和Thy-1-YFP轉(zhuǎn)基因小鼠，我們對(duì)小鼠的組織形態(tài)和神經(jīng)元損傷進(jìn)行評(píng)價(jià)；通過Morris水迷宮和Rota-Rod測(cè)試，我們?cè)u(píng)價(jià)了小鼠的空間記憶及運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功

9、能的改變。
　　研究結(jié)果：
　　第一部分高原低氧加重LPS引起的炎癥反應(yīng)并引起高原腦水腫的發(fā)生
　　1.高原低氧上調(diào)血清與腦組織中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)
　　給予小鼠不同時(shí)間高原低氧暴露，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠血清中IL-1β與IL-6出現(xiàn)上調(diào)，并且隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，其上調(diào)愈加明顯。小鼠腦組織中TNF-α在暴露12小時(shí)出現(xiàn)上調(diào)，在高原低氧暴露24小時(shí)后，腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α均出現(xiàn)明顯上調(diào)。

10、r>　　2.高原低氧加重LPS引起的炎癥反應(yīng)并引起腦水腫的發(fā)生
　　給予小鼠腹腔注射不同劑量的LPS，發(fā)現(xiàn)低劑量LPS對(duì)小鼠腦含水量并無明顯影響（<5 mg/kg）。但是在高原低氧條件下，小鼠腦含水量出現(xiàn)明顯增加。同時(shí)，血清及腦組織中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)明顯上調(diào)。
　　3.高原低氧復(fù)合LPS引起腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞及HIF通路激活
　　對(duì)小鼠腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞及星型膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)

11、現(xiàn)LPS可以引起腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)激活，而對(duì)星型膠質(zhì)細(xì)胞無明顯影響。我們接著對(duì)小鼠腦組織中HIF通路進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在高原低氧及LPS復(fù)合作用下，HIF信號(hào)通路出現(xiàn)明顯激活，HIF-1α、HIF-2α、VEGF的表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào)。
　　4.高原低氧復(fù)合LPS顯著增加血腦屏障通透性
　　對(duì)血腦屏障通透性進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高原低氧暴露及LPS對(duì)小鼠血腦屏障通透性無明顯影響。在二者復(fù)合作用下，血腦屏障通透性明顯在增加。電鏡顯示細(xì)胞間緊密連接

12、出現(xiàn)開放；Western blot顯示緊密連接蛋白Occludin及粘附連接蛋白VE-Cadherin出現(xiàn)明顯下調(diào)。
　　5.高原低氧復(fù)合LPS引起小鼠腦組織神經(jīng)元損傷
　　小鼠腦組織形態(tài)觀察顯示高原低氧及LPS對(duì)小鼠腦組織整體形態(tài)并無明顯影響。在二者復(fù)合作用下，HE染色顯示腦組織中部分細(xì)胞出現(xiàn)胞漿淡染及核深染樣改變；Nissl染色顯示尼氏小體數(shù)量減少，顏色變淺；Thy-1-YFP轉(zhuǎn)基因小鼠顯示投射神經(jīng)元數(shù)量減少，軸突出現(xiàn)萎

13、縮。
　　6.高原低氧復(fù)合LPS引起小鼠認(rèn)知與運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能障礙
　　通過Morris水迷宮及Rota-rod實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠的認(rèn)知及運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高原低氧及LPS對(duì)小鼠的認(rèn)知及運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能無明顯影響。在二者復(fù)合作用下，小鼠首次穿越平臺(tái)的潛伏期明顯延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)的次數(shù)、在目標(biāo)象限運(yùn)動(dòng)的時(shí)間及路程明顯減少；小鼠從轉(zhuǎn)動(dòng)的滾木上掉落的潛伏期及掉落時(shí)滾木的轉(zhuǎn)速明顯減少。
　　第二部分 NB-3的缺失加重高原腦水腫的發(fā)生發(fā)展<

14、br>　　1.神經(jīng)粘附分子NB-3表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元
　　分離小鼠不同的組織器官，Western blot檢測(cè)顯示NB-3只在腦組織中表達(dá)，且 NB-3在腦組織不同腦區(qū)表達(dá)豐度不一。通過對(duì)NB-3免疫熒光染色標(biāo)記顯示NB-3和神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN有共定位現(xiàn)象，而與星型膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物無共定位現(xiàn)象。
　　2.高原低氧下調(diào)腦組織中NB-3的表達(dá)
　　給予小鼠不同時(shí)間高原低氧暴露，發(fā)現(xiàn)高

15、原低氧可以引起NB-3的表達(dá)下調(diào)，并且隨著高原低氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，NB-3的下調(diào)愈加明顯。
　　3.NB-3敲除加重HACE的發(fā)展
　　在發(fā)生HACE時(shí)，與WT小鼠相比，NB-3敲除小鼠腦含水量上升更加明顯，并出現(xiàn)20％的死亡率；NB-3敲除小鼠血腦屏障通透性的增加更加明顯，有更多的伊文斯蘭和IgG從血管中漏出。
　　4.NB-3敲除加重HACE條件下外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)
　　對(duì)不同組小鼠血清及腦組織中炎癥

16、相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè)顯示，在發(fā)生HACE時(shí)，NB-3敲除小鼠血清及腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的上升均較野生小鼠更加劇烈；NB-3敲除小鼠腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活也更加明顯。
　　5.NB-3敲除加重HACE條件下緊密連接的開放
　　在發(fā)生HACE時(shí)，電鏡顯示NB-3敲除小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接的開放、基膜的降解、線粒體的腫脹更加嚴(yán)重；Western blot顯示緊密連接蛋白Occludin及Claudin-5的下

17、調(diào)更加明顯；免疫熒光顯示緊密連接蛋白Occludin及Claudin-5血管內(nèi)定位改變更加劇烈。
　　6.NB-3敲除加重HACE條件下腦部血管擴(kuò)張
　　對(duì)小鼠腦組織大小血管進(jìn)行標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生HACE時(shí)，NB-3敲除小鼠腦組織中大小血管的擴(kuò)張較WT小鼠相比更加劇烈。對(duì)其腦部血流進(jìn)行檢測(cè)顯示NB-3敲除小鼠腦部血流的上升也更加明顯。
　　7.NB-3敲除加重HACE條件下神經(jīng)元的損傷
　　對(duì)小鼠腦組織形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)

18、：在發(fā)生HACE時(shí)，HE染色顯示NB-3敲除小鼠腦組織中出現(xiàn)胞漿淡染及核深染的細(xì)胞更加普遍；Nissl染色顯示尼氏小體數(shù)量的減少及淡染更加明顯；Thy-1-YFP+NB-3敲除小鼠投射神經(jīng)元的減少及軸突萎縮更加嚴(yán)重。
　　8.NB-3敲除加重HACE條件下小鼠認(rèn)知與運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能障礙
　　Morris水迷宮及Rota-rod實(shí)驗(yàn)顯示：在發(fā)生HACE時(shí)，NB-3敲除小鼠首次穿越平臺(tái)的潛伏期延長(zhǎng)更加明顯，穿越平臺(tái)次數(shù)、在目標(biāo)象限運(yùn)

19、動(dòng)時(shí)間和路程的減少更加明顯；從轉(zhuǎn)動(dòng)的滾木上掉落的潛伏期及掉落時(shí)滾木轉(zhuǎn)速減少更加明顯。
　　9.NB-3可能通過影響VEGF通路參與血腦屏障穩(wěn)定的調(diào)節(jié)
　　在發(fā)生高原腦水腫時(shí)，NB-3在星型膠質(zhì)細(xì)胞的終足出現(xiàn)表達(dá)。在發(fā)生HACE時(shí)，不同小鼠腦組織中MMP-9和VEGF的表達(dá)及活性并無明顯差異，但WT小鼠腦組織中VEGFR2的含量較NB-3敲除小鼠下降明顯。同時(shí)WT小鼠腦組織中出現(xiàn)Notch1信號(hào)通路的激活，而NB-3敲除小鼠中

20、Notch1信號(hào)通路并未出現(xiàn)激活。
　　研究結(jié)論：
　　本研究闡明了高原低氧可以明顯加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)，從而引起血腦屏障通透性的增加及神經(jīng)元的損傷，導(dǎo)致高原腦水腫的發(fā)生。在發(fā)生高原腦水腫時(shí)，NB-3的缺失可以通過加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)、加重血管的擴(kuò)張及緊密連接蛋白的降解，增加血腦屏障的通透性，引起神經(jīng)元的損傷加重，進(jìn)而促進(jìn)高原腦水腫的進(jìn)展。該研究明確了炎癥反應(yīng)在高原腦水腫中的調(diào)節(jié)作用，以及神經(jīng)粘附分子NB-3在高原腦水腫發(fā)生中的