神經(jīng)細胞粘附分子（NCAM）在氟致原代培養(yǎng)大鼠海馬細胞毒效應(yīng)中的作用.pdf

1、地方性氟中毒是一種嚴重危害人體健康的全身性疾病。流行病學(xué)調(diào)查證實，氟可影響兒童智力發(fā)育，損害學(xué)習(xí)記憶能力。動物實驗研究也發(fā)現(xiàn)，海馬是氟神經(jīng)毒作用的靶部位。近年來細胞凋亡在氟毒性機制中的作用已引起關(guān)注，人們已從多方面探討了氟誘導(dǎo)凋亡機制，自由基損傷是其中之一，但氟對神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激和凋亡的影響報道較少。 突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶獲得、鞏固和保持的基礎(chǔ)。而在突觸形成及其可塑性的調(diào)節(jié)中，神經(jīng)細胞粘附分子(neuralcelladhesio

2、nmolecules，NCAM)起著極為關(guān)鍵的作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中存在三種主要的受發(fā)育調(diào)控的NCAM亞型：NCAM-180、NCAM-140和NCAM-120，是同一基因隨機剪切的結(jié)果。NCAM主要通過同源性和異源性作用介導(dǎo)細胞的黏附，激活跨膜信息傳導(dǎo)，影響細胞遷移、樹突延伸及突觸的形成，在神經(jīng)發(fā)育及學(xué)習(xí)記憶形成、鞏固和再生等重大腦功能中起著重要的作用。因此，我們設(shè)想氟可能通過影響海馬組織NCAM的表達而產(chǎn)生以學(xué)習(xí)記憶損害為主的神經(jīng)毒作用

3、。 本次研究以大鼠海馬細胞為研究對象，用低劑量氟24h染毒后，觀察氟對海馬細胞氧化應(yīng)激、DNA損傷和凋亡以及NCAMmRNA和蛋白表達水平的影響，初步揭示細胞調(diào)亡和NCAM在氟致神經(jīng)毒性機制中的作用。氟的神經(jīng)毒理研究以大鼠原代海馬細胞為模型以及氟是否對NCAM表達產(chǎn)生影響是本次研究的新穎之處。 本研究主要由以下三部分組成： 第一部分：原代大鼠海馬細胞培養(yǎng)方法的建立和染毒劑量的確定 目的：建立原代大鼠海馬細

4、胞培養(yǎng)方法，探討氟對大鼠海馬細胞存活率的影響，確定后續(xù)實驗的氟染毒劑量。 方法：原代培養(yǎng)的大鼠海馬細胞分別用預(yù)設(shè)濃度20、40、80、160μg/ml氟化鈉染毒24h，觀察不同劑量氟作用后海馬細胞細胞形態(tài)和細胞存活情況；用MTT法測定海馬細胞存活率。 結(jié)果：20、40μg/ml染毒劑量組與對照組相比，其形態(tài)學(xué)改變無明顯差異，80、160μg/ml染毒劑量組神經(jīng)元突起減少、變短，160μg/ml染毒劑量組可見細胞崩解。80

5、、160μg/ml染毒劑量組與對照組細胞存活率相比有顯著性下降(P＜0.05)，160μg/ml劑量組細胞存活率＜50％，其他染毒劑量組與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論：氟可抑制原代培養(yǎng)海馬細胞的存活，高濃度的氟可抑制神經(jīng)元突起的生長，提出氟對發(fā)育中海馬細胞損傷可能是其神經(jīng)毒性的作用位點之一。確定后續(xù)實驗的氟染毒劑量為20、40、80μg/ml。 第二部分：氟對原代培養(yǎng)大鼠海馬細胞氧化應(yīng)激、DNA損傷和凋亡的

6、影響 目的：利用體外實驗方法探討氟對海馬細胞氧化應(yīng)激的影響以及對原代培養(yǎng)大鼠海馬細胞DNA損傷和凋亡的影響。 方法：原代培養(yǎng)海馬細胞暴露于20、40、80μg/ml氟化鈉24h后，分別檢測海馬細胞細胞內(nèi)ROS水平，SOD、GSH-Px活力，GSH、MDA含量，細胞釋放LDH活性，DNA損傷以及凋亡的情況。 結(jié)果：40、80μg/ml劑量組海馬細胞細胞內(nèi)ROS水平、MDA含量、細胞凋亡率、細胞外LDH活性皆明顯高于

7、對照組(P＜0.05)，各劑量組GSH、GSH-Px均顯著低于對照組(P＜0.05)，80μg/ml劑量組SOD活性顯著低于對照組(P＜0.05)，各劑量組彗星Olive尾矩顯著高于對照組(P＜0.05)。同一劑量組細胞內(nèi)ROS水平與細胞凋亡率有明顯正相關(guān)關(guān)系(r=0.913，P＜0.05)。 結(jié)論：氟可引起大鼠海馬細胞細胞膜損傷，導(dǎo)致海馬細胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激、DNA損傷和凋亡，活性氧可能在氟誘導(dǎo)的凋亡中起重要作用。 第三部

8、分：氟對原代大鼠海馬細胞NCAMmRNA和蛋白表達的影響 目的：在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，觀察氟對原代大鼠海馬細胞NCAM表達的影響，研究氟對NCAM表達的劑量-效應(yīng)關(guān)系。 方法：原代培養(yǎng)海馬細胞暴露于20、40、80μg/ml氟化鈉24h后，用RT-PCR和Westernblot方法分別檢測細胞內(nèi)NCAMmRNA和NCAM各蛋白亞型的表達。 結(jié)果：40、80μg/ml劑量組細胞NCAMmRNA表達水平顯著低于對照組