連接粘附分子樣蛋白JAML在動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展中的作用.pdf

1、目的:
　　動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是嚴重危害人類健康的心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，其發(fā)病機制復(fù)雜且尚不完全清楚。越來越多的研究認為AS是一種血管受損后發(fā)生的免疫炎癥過程。連接粘附分子樣蛋白(Junction adhesion molecule-like protein，JAML，Amical)是新近發(fā)現(xiàn)的連接粘附分子(Junctional adhesion molecules，JAMs)家族成員，屬于

2、分泌性的Ⅰ型跨膜糖蛋白?，F(xiàn)有研究表明，JAML主要分布于中性粒細胞、單核/巨噬細胞和多種T細胞等免疫細胞中，通過調(diào)節(jié)單核細胞的粘附和跨內(nèi)皮遷移、γδT細胞釋放炎癥因子和生長因子，在免疫調(diào)控、炎癥反應(yīng)和損傷修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。但是，JAML是否參與了AS這種炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展的病理過程，是否對AS斑塊中的炎癥反應(yīng)和巨噬細胞功能具有調(diào)控作用，至今尚未見報道。因此，本課題從體內(nèi)和體外兩個方面探討JAML在AS發(fā)生和發(fā)展以及對巨噬細胞功能

3、的調(diào)節(jié)作用，從而為防治AS提供新的藥物治療靶點。
　　方法:
　　1.體內(nèi)實驗檢測JAML在AS斑塊中的表達及變化實驗采用冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者的有明顯狹窄和有少量斑塊的冠狀動脈，用免疫組織化學(xué)法觀察JAML的分布情況和表達變化;免疫熒光雙標法和激光共聚焦技術(shù)檢測JAML在斑塊內(nèi)的表達和具體細胞定位。采用ApoE基因敲除(Apolipoprotein Egene knockout，ApoE-/-)合并高脂飲食制備的AS

4、模型小鼠及其遺傳背景C57BL/6小鼠作為實驗對照，利用蛋白免疫印跡法檢測JAML在AS斑塊組織內(nèi)表達水平的變化。
　　2.體內(nèi)實驗探討JAML在AS發(fā)生和發(fā)展過程中的作用及對斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)和NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)實驗利用ApoE-/-小鼠分別制備早期AS斑塊模型和晚期AS易損斑塊模型，兩種實驗動物模型均采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法分別轉(zhuǎn)染目的基因JAML shRNA或轉(zhuǎn)染對照shRNA。每組動物采用酶法檢測血清中總膽固醇(Total

5、cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein，LDL)和高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)水平;利用大體油紅O染色測定主動脈的斑塊面積;冰凍切片進行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色、油紅O染色、免疫組織化學(xué)染色、天狼猩紅染色分別檢測斑塊面積、脂質(zhì)含量、巨噬細胞浸潤、平滑肌細胞以及膠

6、原含量，并最終計算斑塊的易損指數(shù);免疫組織化學(xué)方法檢測斑塊組織中炎癥因子白介素(Interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(Tumer necrosis factor-α，TNFα)的表達水平;蛋白免疫印跡技術(shù)檢測磷酸化p65表達水平觀察核因子κB(Neuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路的活化情況。
　　3.體外實驗驗證JAML在oxLDL活化的單核/巨噬細胞中的作用及對NF-κB信號通路

7、的調(diào)控選取可以代表斑塊內(nèi)主要細胞成分的原代臍靜脈內(nèi)皮細胞、人外周血單核細胞、小鼠單核/巨噬細胞RAW264.7和平滑肌細胞株，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(Reverse transcription-PCR，RT-PCR)技術(shù)檢測了JAML基因的表達水平;小鼠單核/巨噬細胞株RAW264.7給予不同濃度或不同時間點的氧化型低密度脂蛋白(Oxidized-low density lipoprotein，oxLDL)、脂多糖(Lipopoly

8、saccharide，LPS)、TNFα不同刺激物刺激，蛋白免疫印跡法檢測JAML的表達變化;采用小干擾RNA脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默巨噬細胞中JAML的表達，實時定量RT-PCR方法檢測oxLDL刺激的巨噬細胞中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein1，MCP-1)、IL-10 mRNA水平的變化，并且用蛋白免疫印跡的方法檢測磷酸化p65的表達觀察NF-κ

9、B信號通路的活化情況。
　　結(jié)果:
　　1.體內(nèi)實驗表明，與有少量斑塊的冠狀動脈相比，具有明顯狹窄的AS患者的斑塊組織內(nèi)JAML的表達量明顯升高;免疫熒光雙標結(jié)果顯示JAML在斑塊內(nèi)的巨噬細胞中表達較為豐富，在斑塊內(nèi)其他兩種主要細胞成分-內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中也有少量表達。同樣的結(jié)果也在小鼠AS模型中得到了進一步的證實，與正常C57BL/6小鼠相比，ApoE-/-AS模型小鼠主動脈中JAML的表達明顯上調(diào)。
　　2.動

10、物實驗進一步證實，早期和晚期兩種AS斑塊模型均表現(xiàn)為JAML基因沉默與對照組相比，體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異，同時血清學(xué)檢測顯示小鼠TC、TG、LDL和HDL水平也無顯著性差異;主動脈大體油紅O染色顯示JAML基因沉默可以明顯減少早期AS斑塊的形成;各種病理學(xué)和免疫組織化學(xué)染色顯示干擾JAML表達可以減少早期和晚期斑塊內(nèi)的脂質(zhì)含量和巨噬細胞浸潤，增加平滑肌細胞以及膠原含量，最終降低斑塊的易損指數(shù)，穩(wěn)定斑塊;免疫組織化學(xué)染色顯示JAML基因缺陷可以

11、明顯減輕斑塊組織中炎癥因子IL-6、TNF-α的表達和NF-κB信號通路的激活。
　　3.體外實驗進一步驗證了JAML在斑塊組織內(nèi)的細胞定位;用oxLDL或TNF-α刺激巨噬細胞，JAML蛋白表達呈現(xiàn)明顯的濃度和時間依賴性的升高，但LPS對JAML的表達量無明顯影響。進一步實驗結(jié)果顯示，下調(diào)巨噬細胞JAML的表達水平，可明顯降低oxLDL刺激所導(dǎo)致的IL-6、TNF-α的mRNA水平的升高，但是對IL-1β、MCP-1、IL-10

12、的mRNA水平的影響無統(tǒng)計學(xué)差異;另外，干擾JAML蛋白表達也可以抑制NF-κB信號通路的活化。
　　結(jié)論:
　　1.首次檢測了JAML在AS斑塊中的表達和細胞定位。證實了JAML在AS斑塊中表達升高，且主要在巨噬細胞中表達，在內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中也有少量表達，提示JAML有可能參與了AS斑塊內(nèi)多種細胞成分的功能調(diào)節(jié)。
　　2.首次證明了JAML促進AS的發(fā)生和發(fā)展過程，因此，下調(diào)JAML的表達可以抑制AS斑塊的形成

13、，減輕斑塊中的炎癥反應(yīng)，增加晚期AS斑塊的穩(wěn)定性。
　　3.初步探討了JAML促進AS發(fā)生和發(fā)展的機制，驗證了JAML可以加重AS斑塊中巨噬細胞的功能紊亂，導(dǎo)致巨噬細胞分泌炎癥因子增多及NF-κB信號通路的活化。
　　綜上所述，本課題一方面將為防治AS提供新的藥物治療靶點，揭示針對JAML的靶向治療有可能成為臨床防治AS特別是抗炎治療的新的治療策略;另一方面，JAML作為一種分泌性蛋白將有可能作為AS斑塊早期診斷和晚期穩(wěn)定性