利用原子力顯微鏡對雙鏈DNA堿基相互作用力的檢測.pdf

1、為了探討細胞內(nèi)部的基因表達調(diào)控、信息傳導、物質(zhì)代謝和能量轉換過程在維系細胞的正常生物學行為中的作用，認識這些過程的非正常化如何導致細胞的非正常生物行為，人們不僅需要在分子水平上了解每個生化過程的內(nèi)涵，而且還需要對細胞的形貌特征、物理學性質(zhì)以及生理學信息進行全面的解析和詮釋。利用微觀測與微操控技術檢測細胞在不同的生理和病理狀態(tài)下的形貌特征和物理學特性，從中提取能夠反映細胞內(nèi)部生物反應和細胞狀態(tài)的生物標志物信息，揭示細胞物理學參數(shù)與細胞生物

2、學性狀的關聯(lián)性，我們可以通過研究生物大分子之間的相互作用來奠定前期工作基礎。原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope，AFM)作為上個世紀80年代發(fā)明的一種獲取物體表面納米尺度信息的工具，為細胞與亞細胞結構及相互作用力的相關研究提供了強有力的技術手段。
　　我們在本研究中主要利用AFM的技術特點，初步分析在大氣和液體環(huán)境中對不同樣品進行形態(tài)學上的掃描研究，對于AFM在液體條件中的操作條件進行優(yōu)化對比。以此來考查

3、在接近生理條件的緩沖溶液環(huán)境下，利用AFM來進行檢測的優(yōu)勢，并優(yōu)化在液相環(huán)境中對樣品進行形貌掃描分析的操作條件。同時我們利用天然的云母片、醛基修飾的玻璃片等，對其進行形態(tài)特征進行研究，從而為了在研究生物樣品時，可以選擇更加適用于液體環(huán)境操作的AFM基底。在原子力顯微鏡研究生物樣品的操作中，常用的基底材料一般采用化學修飾的基底或者云母片。云母片表面具有電荷，固定樣品可以通過靜電吸附作用來實現(xiàn)，而樣品通過化學修飾到基底表面和云母片的靜電吸附

4、相比較，化學修飾可以增加基底表面結合的生物樣品數(shù)量，同時共價鍵的作用力大于靜電吸附，因此，我們需要參考進行下一步研究的目的和方案，來進行基底材料的選擇。為后期工作利用AFM在接近生理的條件下研究生物大分子間的相互作用，形態(tài)活性，以及研究一些重要的生物學動態(tài)過程，提供科學的實驗基礎。另外，通過我們的研究發(fā)現(xiàn)，AFM在液體條件下可以消除表面毛細作用和靜電力的干擾，因此在液體條件中所得的樣品形貌圖像更能反映出被測樣品的真實狀態(tài)。
　　其

5、次我們對AFM在氣相和液相條件下的探針力-距離曲線進行了分析比對，并以此測量生物大分子間的相互作用力。同時，我們對實驗過程中的技術操作問題進行了改進，如減少溫漂問題、彈性系數(shù)精準測量的方法、Trigger mode的選擇、XY方向大范圍內(nèi)閉環(huán)系統(tǒng)的選擇、控制的多樣性優(yōu)化選擇。在力-距離曲線的測量中，由于采集的數(shù)據(jù)是通過AFM探針與基底彈性力的改變實時監(jiān)測后得出的，為了解決數(shù)據(jù)信息量大的問題，我們選擇聚類分析算法進行數(shù)據(jù)處理。對k-mea

6、ns算法的深入分析過程中發(fā)現(xiàn)選擇適當?shù)某跏假|(zhì)心是k-means算法執(zhí)行過程的關鍵步驟，因此我們對其進行改進，對數(shù)據(jù)分析的算法程序進行了改編，為解析生理條件下生物分子之間的相互作用力及生物反應過程中的動力學奠定初步的數(shù)據(jù)分析手段。原子力顯微鏡在液相條件下進行分子間作用力測量的操作中，我們針對實驗過程中的技術操作及數(shù)據(jù)處理方面進行了優(yōu)化，通過改變實驗條件降低了溫飄的影響，通過液體動力學模型對彈性系數(shù)進行精確測量，選用trigger mode

7、模式來消除基底的影響，選取XY方向大范圍內(nèi)閉環(huán)系統(tǒng)來增大掃描范圍，降低位置漂移，改變多個參量，達到多樣化的控制;同時對k-means算法進行了程序上的改進，這不同于實驗條件的優(yōu)化，而是針對控制程序進行的改良。
　　第三，目前的實驗手段在針對DNA分子雙螺旋結構的研究中，還無法測量出與解鏈溫度直接相關的雜交雙鏈的成鏈親和力，無法分辨出互補雜交雙鏈的鏈間相互作用和鏈內(nèi)相互作用，也就是雙鏈DNA分子間的氫鍵結合力和堿基堆積力。為了能夠在

8、分子水平上全面系統(tǒng)地認識基因探針-靶標核酸雜交雙鏈的成鍵特性，認識基因探針對靶標核酸和非靶標核酸的辨異能力，我們利用原子力顯微鏡測量基因探針與靶標核酸相互結合時的力-距離曲線，并由此導出最直接的物理參數(shù):氫鍵結合力和堿基堆積力。以自行設計的兩種測量模式為基礎，即解螺旋模式和拉伸模式分別測量DNA雙鏈的成鍵特性，并計算出氫鍵結合力和堿基堆積力。有關DNA雙螺旋結構中堿基堆積力的測量，這方面的工作還未見報道，多見的是氫鍵結合力的測量，我們設

9、計模式中的拉伸模式即對應于堿基堆積力的測量。在形成DNA雙螺旋的過程中，NaCl濃度的影響是至關重要的，而文獻中對于鹽濃度的選擇并無統(tǒng)一的標準;同時，對于探針在基底表面的停留時間以及探針的加載速度也無準確的報道，這些不確定因素導致文獻中，DNA雙螺旋結構的氫鍵結合力測量數(shù)據(jù)的不一致性。因此，我們在進行雙鏈DNA分子互補雜交雙鏈的鏈間相互作用和鏈內(nèi)相互作用的測量中，對上述條件進行了選擇性優(yōu)化，從而得出在目前條件下比較穩(wěn)定的測量方法，并推導

10、出雙鏈DNA分子間的氫鍵結合力和堿基堆積力。這種pN級力的數(shù)據(jù)積累，對于研究病理條件下雙鏈DNA分子間作用力的變化具有指導意義。在利用原子力顯微鏡進行雙鏈DNA分子間的氫鍵結合力和堿基堆積力測量的時候，我們設計了含有10、14、20bp堿基對的寡核苷酸序列，形成G-C及A-T完全匹配的互補序列，通過對探針表面及醛基玻片基底分別進行化學修飾，并利用解螺旋模式和拉伸模式進行測量，選擇NaCl濃度為100mM，探針在基底表面停留時間為10s、