原子力顯微鏡用于細胞表面結構與性質的研究以及單堿基錯配的檢測.pdf

1、生物大分子所構筑的細胞表面(細胞壁、細胞膜)是細胞與外界環(huán)境間進行物質和能量交換的屏障，也是一些物理、化學因素作用于細胞的靶點之所在。在納米水平上研究細胞表面的基本結構及其受外界環(huán)境作用前后的變化，對于認識細胞表面結構與功能之間的關系，全面評價藥效并對藥物合成路線提供參考都具有重要意義。另一方面，單堿基錯配的檢測對于從分子水平上闡明多種疾病形成的原因，實現(xiàn)基因水平的治療都是至關重要的前提條件。發(fā)展具有高靈敏度、高選擇性的單堿基錯配檢測方

2、法勢在必行。上述兩個研究領域都已經(jīng)成為生物分析化學研究的前沿和熱點。 本論文以上述科學問題為研究目標，充分利用原子力顯微鏡(AFM)能夠在大氣及液下高分辨成像和對微弱相互作用力敏感的優(yōu)勢，表征了不同藥物以及脈沖電場(PEF)對細菌細胞壁表面形態(tài)和構成的影響，考察了細胞在大氣氛和液下成像的條件，發(fā)展了基于力測定并結合發(fā)夾型探針的高靈敏、高選擇性的單堿基錯配檢測方法。主要內(nèi)容歸納如下： 1、基于AFM大氣氛中成像，研究天然與

3、半合成內(nèi)酰胺類抗生素對大腸桿菌形態(tài)的影響。選擇具有微小分子結構差別的天然(青霉素)和半合成(阿莫西林)抗生素，分別對大腸桿菌進行作用。利用AFM大氣氛中制樣簡便、輕敲模式成像分辨率高、樣品損傷性小的優(yōu)勢，對藥物的作用效果進行了表征。觀察到這兩種藥物在細菌表面造成的納米水平上小孔狀損傷的密度和發(fā)生位點均存在區(qū)別，從形態(tài)學角度解釋了阿莫西林比青霉素藥效強的原因。作為對照的氧氟沙星未使細菌表面出現(xiàn)顯著的損傷。該結果在納米水平上證明了不同抗生素

4、的藥效，同時也表明AFM能夠為研究藥物分子結構與作用效果的關系提供新的表征手段。 2、結合AFM液下成像和力測定兩種技術，研究了PEF對細菌表面結構與構成的影響。對通過靜電吸附固定于基底上的細菌樣品，原位施加不同劑量的PEF，表征了菌體形態(tài)及其與AFM探針的相互作用力的變化。結果表明隨著PEF劑量的增加，細菌表面損傷的程度逐漸增大，具體表現(xiàn)為細菌數(shù)目的減少、相互作用力的增大以及力曲線上出現(xiàn)多粘附相互作用特征區(qū)。對照實驗表明相互作

5、用力的變化是由于細胞壁外層的肽聚糖分子網(wǎng)絡狀結構被破壞，從而使內(nèi)膜中的蛋白組分暴露所致。該結果在分子水平上證明了PEF對細菌表面的影響，同時也表明AFM是研究細胞表面組分變化與外界物化刺激之間相互關系的強有力的工具。 3、氣氛中及生理環(huán)境下AFM細胞成像的實現(xiàn)及條件優(yōu)化。首先，比較了三種常用的固定劑對三種細胞在大氣氛中成像效果的影響。其中，0.5％的戊二醛具有對細胞細微結構的最佳保留能力。在此基礎上，進一步考察了掃描速度和不同培

6、養(yǎng)基環(huán)境對細胞液下成像的影響并進行了條件優(yōu)化。貼壁生長的腎系膜細胞和腎小管上皮細胞均可在培養(yǎng)基中直接進行成像，細胞骨架清晰。該結果為將AFM成像和力測定及其聯(lián)用技術應用到細胞水平搭建了一座橋梁。 4、AFM力譜分析用于增強發(fā)夾型探針的單堿基錯配檢測能力。將探針與完全互補和一系列含有不同類型單堿基錯配的互補序列分別修飾到針尖與基底上，通過測量探針與完全互補以及錯配序列之間的相互作用力，對單堿基錯配進行檢測。不同于熒光檢測時