小麥TaPK3A和TaTT12基因功能分析及轉DmAMP1W基因小麥的分子與功能鑒定.pdf

1、小麥穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)對于保障全球糧食安全至關重要。小麥紋枯病(wheat sharp eyespot)，是由禾谷絲核菌(Rh izoctonia cerealis)引起的土傳真菌病害，近年來已成為我國小麥生產(chǎn)的重要限制因素。由于生產(chǎn)上小麥紋枯病鑒定困難，高抗小麥紋枯病的育種材料缺乏，關鍵的小麥抗紋枯病基因尚未分離出來，導致抗紋枯病小麥育種徘徊不前。系統(tǒng)地研究小麥防御反應分子基礎，發(fā)掘有效的抗紋枯病基因是小麥抗紋枯病育種突破的前提。本研究對2個

2、受禾谷絲核菌誘導的小麥基因TaPK3A和TaTT12進行了表達譜分析，初步研究了它們在小麥抗紋枯病反應中的功能。此外，本研究還按照小麥偏愛的編碼子人工合成了一個抗菌肽基因DmAMPlW,進行了體外抑菌試驗和轉基因小麥的分子檢測與接種抗病鑒定，研究了其抗病功能。主要結果如下:
　　本研究從抗紋枯病小麥品種CI12633中克隆出一個類受體蛋白激酶(receptor-like proteinkinase,RLK)基因TaPK3A，并對其

3、表達特性及抗紋枯病功能進行了分析、驗證。TaPK3A基因的開放閱讀框長度為1983bp，編碼660個氨基酸組成的類受體蛋白激酶。TaPK3A在抗紋枯病小麥品種CI12633中受紋枯病菌的誘導而顯著上調表達。TaPK3A在根、莖、葉、穗中都有表達，在葉中的表達量最高，并且TaPK3A的表達受植物激素水楊酸的誘導最為顯著。利用大麥條形花葉病毒(barley stripe mosaic virus，BSMV)誘導的基因沉默(virus-ind

4、uced gene silencing，VIGS)技術，降低抗紋枯病小麥CI12633中TaPK3A的轉錄水平，再接種紋枯病原菌WK207進行紋枯病抗性鑒定。結果顯示，與對照CI12633植株相比，TaPK3A轉錄量下降的CI12633植株對紋枯病的抗性顯著降低，說明TaPK3A是小麥防御紋枯病反應所需的。
　　本研究中對一個多藥物有毒化合物排出(Multidrug and toxic compound extrusion fam

5、ily,MATE family)家族基因TaTT12的表達特性和抗紋枯病相關的作用進行了初步的研究。在抗紋枯病小麥品種CI12633和山紅麥及感紋枯病小麥品種溫麥6中，TaTT12的表達受紋枯病菌的誘導而顯著上調，并且TaTT12在CI12633和山紅麥中的表達量顯著高于溫麥6。對CI12633處理的4種植物激素中，茉莉酸甲酯對TaTT12的誘導最為顯著。BSMV-VIGS試驗結果顯示，TaTT12的沉默導致CI12633對紋枯病抗性顯

6、著下降，且防衛(wèi)基因defensin和PR12轉錄水平也受到顯著抑制，表明TaTT12通過調控防衛(wèi)基因defensin和PR12的表達而正向參與小麥抗紋枯病反應。
　　為了明確人工合成的大麗花抗菌肽基因DmAMP1W是否具備抗小麥真菌病害的能力，進行了體外抑菌試驗。結果表明，DmAMP1W可以抑制小麥紋枯病菌、小麥根腐病菌和小麥全蝕病菌的菌絲生長，對小麥莖基腐病菌菌絲生長也有一定的抑制作用。同時，將轉基因載體pWMB122-DmAM

7、P1W通過農(nóng)桿菌介導法轉入到小麥品種周麥18中，獲得轉DmAMP1W基因小麥。利用轉基因特異PCR、半定量RT-PCR以及Western blot對轉DmAMP1W基因小麥進行了3代分子特征分析。結果表明，DmAMP1W能在T1-T2代轉基因小麥中遺傳和表達。對T1-T2代轉DmA MP1W基因小麥株系的紋枯病病級進行分析，結果表明，與受體周麥18相比，AMP166、AMP163、AMP169、AMP544和AMP552五個轉基因株系連