小麥TaPK3A和TaTT12基因功能分析及轉(zhuǎn)DmAMP1W基因小麥的分子與功能鑒定.pdf

1、小麥穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)對(duì)于保障全球糧食安全至關(guān)重要。小麥紋枯病(wheat sharp eyespot)，是由禾谷絲核菌(Rh izoctonia cerealis)引起的土傳真菌病害，近年來(lái)已成為我國(guó)小麥生產(chǎn)的重要限制因素。由于生產(chǎn)上小麥紋枯病鑒定困難，高抗小麥紋枯病的育種材料缺乏，關(guān)鍵的小麥抗紋枯病基因尚未分離出來(lái)，導(dǎo)致抗紋枯病小麥育種徘徊不前。系統(tǒng)地研究小麥防御反應(yīng)分子基礎(chǔ)，發(fā)掘有效的抗紋枯病基因是小麥抗紋枯病育種突破的前提。本研究對(duì)2個(gè)

2、受禾谷絲核菌誘導(dǎo)的小麥基因TaPK3A和TaTT12進(jìn)行了表達(dá)譜分析，初步研究了它們?cè)谛←溈辜y枯病反應(yīng)中的功能。此外，本研究還按照小麥偏愛(ài)的編碼子人工合成了一個(gè)抗菌肽基因DmAMPlW,進(jìn)行了體外抑菌試驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因小麥的分子檢測(cè)與接種抗病鑒定，研究了其抗病功能。主要結(jié)果如下:
　　本研究從抗紋枯病小麥品種CI12633中克隆出一個(gè)類受體蛋白激酶(receptor-like proteinkinase,RLK)基因TaPK3A，并對(duì)其

3、表達(dá)特性及抗紋枯病功能進(jìn)行了分析、驗(yàn)證。TaPK3A基因的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1983bp，編碼660個(gè)氨基酸組成的類受體蛋白激酶。TaPK3A在抗紋枯病小麥品種CI12633中受紋枯病菌的誘導(dǎo)而顯著上調(diào)表達(dá)。TaPK3A在根、莖、葉、穗中都有表達(dá)，在葉中的表達(dá)量最高，并且TaPK3A的表達(dá)受植物激素水楊酸的誘導(dǎo)最為顯著。利用大麥條形花葉病毒(barley stripe mosaic virus，BSMV)誘導(dǎo)的基因沉默(virus-ind

4、uced gene silencing，VIGS)技術(shù)，降低抗紋枯病小麥CI12633中TaPK3A的轉(zhuǎn)錄水平，再接種紋枯病原菌WK207進(jìn)行紋枯病抗性鑒定。結(jié)果顯示，與對(duì)照CI12633植株相比，TaPK3A轉(zhuǎn)錄量下降的CI12633植株對(duì)紋枯病的抗性顯著降低，說(shuō)明TaPK3A是小麥防御紋枯病反應(yīng)所需的。
　　本研究中對(duì)一個(gè)多藥物有毒化合物排出(Multidrug and toxic compound extrusion fam

5、ily,MATE family)家族基因TaTT12的表達(dá)特性和抗紋枯病相關(guān)的作用進(jìn)行了初步的研究。在抗紋枯病小麥品種CI12633和山紅麥及感紋枯病小麥品種溫麥6中，TaTT12的表達(dá)受紋枯病菌的誘導(dǎo)而顯著上調(diào)，并且TaTT12在CI12633和山紅麥中的表達(dá)量顯著高于溫麥6。對(duì)CI12633處理的4種植物激素中，茉莉酸甲酯對(duì)TaTT12的誘導(dǎo)最為顯著。BSMV-VIGS試驗(yàn)結(jié)果顯示，TaTT12的沉默導(dǎo)致CI12633對(duì)紋枯病抗性顯

6、著下降，且防衛(wèi)基因defensin和PR12轉(zhuǎn)錄水平也受到顯著抑制，表明TaTT12通過(guò)調(diào)控防衛(wèi)基因defensin和PR12的表達(dá)而正向參與小麥抗紋枯病反應(yīng)。
　　為了明確人工合成的大麗花抗菌肽基因DmAMP1W是否具備抗小麥真菌病害的能力，進(jìn)行了體外抑菌試驗(yàn)。結(jié)果表明，DmAMP1W可以抑制小麥紋枯病菌、小麥根腐病菌和小麥全蝕病菌的菌絲生長(zhǎng)，對(duì)小麥莖基腐病菌菌絲生長(zhǎng)也有一定的抑制作用。同時(shí)，將轉(zhuǎn)基因載體pWMB122-DmAM

7、P1W通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入到小麥品種周麥18中，獲得轉(zhuǎn)DmAMP1W基因小麥。利用轉(zhuǎn)基因特異PCR、半定量RT-PCR以及Western blot對(duì)轉(zhuǎn)DmAMP1W基因小麥進(jìn)行了3代分子特征分析。結(jié)果表明，DmAMP1W能在T1-T2代轉(zhuǎn)基因小麥中遺傳和表達(dá)。對(duì)T1-T2代轉(zhuǎn)DmA MP1W基因小麥株系的紋枯病病級(jí)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，與受體周麥18相比，AMP166、AMP163、AMP169、AMP544和AMP552五個(gè)轉(zhuǎn)基因株系連