小麥BR合成基因TaDWF4的鑒定與功能分析.pdf

1、小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物之一，它的生產(chǎn)直接影響著全球的糧食安全。小麥能夠提供人類20％的熱量和蛋白質(zhì)，同時也是我國的第二大糧食作物。油菜素類固醇(Brassinosteroids，BR)是重要的植物生長激素，在植物生長發(fā)育的各個階段發(fā)揮著重要的作用。目前對BR合成的調(diào)控機(jī)理及其對植物生長發(fā)育影響的研究主要在水稻、擬南芥中，而在重要的糧食作物小麥中鮮有報道。DWF4在BR合成路徑中是一個關(guān)鍵的限速酶基因。為了解DWF4基因在小麥生長發(fā)育

2、過程中的作用，本研究以同源搜索的方式從小麥中克隆得到的與擬南芥BR合成路徑中的關(guān)鍵合成基因AtDWF4同源的基因為對象，命名為TaD WF4，同時存在反饋抑制現(xiàn)象，構(gòu)建由35S驅(qū)動的TaDWF4超表達(dá)載體35S∷ TaDWF4，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得多個TaDWF4轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，觀察擬南芥表型的差異。得到以下主要結(jié)論:
　　1.以擬南芥AtDWF4在小麥基因數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源搜索，通過進(jìn)化樹分析、結(jié)構(gòu)域分析、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析和序列

3、完整度分析，最終確定小麥BR合成基因TaDWF4是Traes_4AS_C318715F9.1和Traes_4BL_BAFA18B1D.1。
　　2.通過實(shí)時定量PCR檢測，當(dāng)外施高濃度BR后，小麥TaDWF4基因的表達(dá)量就會顯著降低，說明小麥TaDWF4存在BR反饋抑制現(xiàn)象。
　　3.采用Gateway體外重組技術(shù)進(jìn)行小麥TaDWF4基因的克隆，克隆結(jié)果顯示，Traes_4BL_BAFA18B1D.1測序結(jié)果與小麥數(shù)據(jù)庫提供

4、序列一致，而Traes_4AS_C318715F9.1在426位測序少了一個氨基酸谷氨酰胺Gln，因此我們認(rèn)為小麥數(shù)據(jù)庫提供的Traes_4AS_C318715F9.1基因序列是有誤的，正確的氨基酸序列應(yīng)該是缺少谷氨酰胺的。
　　4.將構(gòu)建好的TaDWF4基因超表達(dá)載體35S∷TaDWF4轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101中，農(nóng)桿菌侵染擬南芥Col、Ws2、雜合dwf4-44和bri1-5。經(jīng)除草劑篩選和目的基因PCR鑒定，共得到轉(zhuǎn)基因植

5、株337株。
　　5.觀察轉(zhuǎn)基因陽性植株的表型發(fā)現(xiàn)，小麥TaDWF4基因轉(zhuǎn)野生型Col、Ws2和dwf4-44突變體后，與轉(zhuǎn)基因背景相比，植株都表現(xiàn)為葉柄明顯變長，同時葉形也發(fā)生了變化，蓮座葉的長度和寬度均減少，長寬比變大，葉面積變小，且蓮座葉兩側(cè)向內(nèi)卷曲。小麥TaDWF4基因在bri1-5中超表達(dá)后使bri1-5突變體表型得以部分恢復(fù)，超表達(dá)植株葉柄明顯變長，同時蓮座葉葉形也發(fā)生變化，蓮座葉卷曲程度下降，且長寬比變大，這與超表達(dá)