小麥TaNCED1基因的表達載體構建及功能分析.pdf

1、小麥是世界重要糧食作物之一，在全球氣候變暖，各種極端天氣出現頻率同益增加的情況下，提高其對不良環(huán)境的適應性，保證小麥的高產、穩(wěn)產具有重要意義。脫落酸(ABA)作為一種在植物的整個生命循環(huán)中起著重要作用的激素，對種子的發(fā)育和休眠以及適應各種外界環(huán)境的脅迫反應的調控都有十分重要的作用。通過改變ABA生物合成路徑關鍵基因的、表達來調節(jié)植物體內ABA的水平是提高植物抗逆性一個重要途徑。 9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)催化9

2、-順式-紫黃質或9-順式-新黃質產生黃質醛，被認為是ABA合成中的一個關鍵酶，并對ABA的合成調控起十分重要的作用。在干旱、高鹽等逆境條件下，NCED基因的表達可以提高植物體內ABA的含量，增強植物對逆境脅迫的抗逆性。 本研究在已從小麥中克隆到三個TaNCED1基因(TaNCED1-2、-3、-7)的基礎上，通過構建TaNCED1基因的表達載體，并將其轉入模式植物擬南芥中，并對轉基因植株在鹽和ABA脅迫條件下的表現進行鑒定，初步

3、鑒定分析TaNCED1基因的功能及其多樣性。主要結果如下： 1、通過PCR的方法從克隆載體上擴增獲得了三個目的基因，利用KpnI和XbaI兩種限制性內切酶對擴增產物及表達載體pCAMBIA2300-35S進行雙酶切后連接，并將連接產物轉入大腸桿菌DH10B，篩選到含有目的基因的重組質粒，構建了三個TaNCED1的表達載體，并采用PCR和酶切的方法進行了驗證，并將驗證后的質粒采用凍融法導入到農桿菌GV3101中，完成表達載體的構建

4、。 2、通過floral dip的方法將TaNCED1-2、TaNCED1-3、TaNCED1-7三個基因分別轉入到擬南芥中，經初步篩選分別得到13、24、45株具有Kan抗性的轉化苗，經PCR進一步驗證共得到得到79株陽性轉化植株，陽性率為96.3％。對轉基因植株T2、T3代繼續(xù)進行PCR篩選，每個TaNCED1基因得到4個純合轉基因株系，分別命名為S21～S24、S31～S34、S71～S74。 3、對純合轉基因株系

5、S21、S31和S71進行了ABA的敏感性試驗，結果表明在沒有添加ABA的培養(yǎng)基上，S71和WT種子在萌發(fā)上存在顯著的差異，S21和S31的萌發(fā)也受到一定程度的影響但不如S71顯著。在添加0.5 μmol/LABA培養(yǎng)基上，S21、S71和WT之間差異顯著，S31的萌發(fā)和WT之間也有差異，但是不如而S21和S71明顯。以上結果表明TaNCED1基因的過量表達可能使種子內的ABA的水平增高，延長了種子的休眠，使種子萌發(fā)速率減慢。轉三個Ta

6、NCED1基因的株系存在一定程度的差別，可能與它們在功能上存在一定的差別有關。 4、將S21、S71和WT的種子播種在含有不同濃度的NaCl培養(yǎng)基上，并對其表型進行分析，結果表明隨著NaCl濃度的增加，轉基因株系S21和S71種子的萌發(fā)和幼苗生長受到嚴重的抑制，在低濃度的NaCl脅迫下，過量表達TaNCED1的轉基因株系和WT之間直接存在明顯的差異。在高濃度的NaCl脅迫下，所有的種子萌發(fā)都受到抑制，但轉基因植株受到的抑制更加明