基于增強(qiáng)共反應(yīng)試劑作用效率的策略構(gòu)建電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的研究.pdf

1、電致化學(xué)發(fā)光（ECL）免疫分析技術(shù)，結(jié)合了ECL分析技術(shù)的高靈敏度和高可控性與免疫識別的高特異性，能顯著提高生物蛋白分子檢測的靈敏度和選擇性，在免疫生物學(xué)和臨床檢驗學(xué)等研究中展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。向ECL體系中引入共反應(yīng)劑可顯著增強(qiáng)其ECL強(qiáng)度，有效提高免疫傳感器靈敏度。然而，一些共反應(yīng)試劑存在不穩(wěn)定、難標(biāo)記的缺點(diǎn)，增加了操作難度和測量誤差。并且，傳統(tǒng)的基于發(fā)光試劑和共反應(yīng)試劑分子間相互作用的ECL類型電子傳遞距離長、能量損失大、穩(wěn)定性

2、欠佳?；诖?，本論文主要從提高共反應(yīng)試劑的作用效率出發(fā)，通過酶催化原位產(chǎn)生共反應(yīng)試劑及合成新型自增強(qiáng)型ECL試劑，并結(jié)合多種納米復(fù)合物的輔助，構(gòu)建多個ECL免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)多種疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的靈敏檢測。本論文的研究工作主要分為以下幾部分：
　　1.基于雙酶催化原位產(chǎn)生共反應(yīng)試劑的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的研究
　　由于某些共反應(yīng)試劑不穩(wěn)定、難于標(biāo)記的缺點(diǎn)使得一些ECL體系的應(yīng)用受到了很大的限制。本研究利用酶催化反應(yīng)在電極表面原

3、位產(chǎn)生共反應(yīng)試劑很好地解決這一問題。研究表明，葡萄糖氧化酶及辣根過氧化物酶可以協(xié)同催化底物葡萄糖水解并產(chǎn)生O2。因此，本工作中我們提出一種雙酶協(xié)同催化原位產(chǎn)生O2的策略，并成功將其應(yīng)用于S2O82--O2ECL體系，實(shí)現(xiàn)了信號的放大及穩(wěn)定性的提高?；谠撾p酶催化放大策略并結(jié)合 L-半胱氨酸及金納米顆粒對ECL反應(yīng)的促進(jìn)作用，構(gòu)建了一個簡單、免標(biāo)記，且具有高靈敏度及高選擇性的ECL免疫傳感器，并將其應(yīng)用于甲胎蛋白（AFP）的檢測。該工作為

4、基于S2O82--O2 ECL體系的傳感器的構(gòu)建提出了一種新型的信號放大方法，并拓寬了其應(yīng)用。
　　2.基于富勒烯功能化的鈀納米籠及仿雙酶原位產(chǎn)生共反應(yīng)試劑的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的研究
　　本研究中利用納米材料作為仿酶很好地克服生物酶易失活、反應(yīng)條件苛刻等缺點(diǎn)，拓寬了酶催化反應(yīng)的應(yīng)用范圍。以銀納米立方為模板，通過置換反應(yīng)制得內(nèi)部空虛外部多孔的鈀納米籠結(jié)構(gòu)（PdNCs），并修飾上L-半胱氨酸（L-Cys）功能化的富勒烯（C6

5、0）得到C60-L-Cys-PdNCs復(fù)合納米材料。由于其良好的電催化活性及大的比表面積，C60-L-Cys-PdNCs可以很好地應(yīng)用于生物傳感器的構(gòu)建。本工作中我們利用C60-L-Cys-PdNCs固載葡萄糖氧化酶、二抗蛋白，構(gòu)建了檢測豬鏈球菌（SS2）的夾心型電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。C60-L-Cys作為S2O82-O2 ECL體系的新型的共反應(yīng)試劑極大地增強(qiáng)了ECL強(qiáng)度。并且，在底物葡萄糖存在的情況下，葡萄糖氧化酶與PdNCs構(gòu)成

6、仿雙酶體系：葡萄糖氧化酶催化底物葡萄糖生成過氧化氫（H2O2），而PdNCs作為辣根過氧化物酶的模擬酶進(jìn)一步催化H2O2分解產(chǎn)生O2，進(jìn)而顯著增強(qiáng)了S2O82--O2體系的ECL信號。該傳感器的線性范圍為0.1 pgmL-1~100 ng mL-1，檢出限為33.3 fg mL-1。
　　3.基于綠色方法合成鈀納米線的自增強(qiáng)型電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的研究
　　傳統(tǒng)的ECL反應(yīng)中，發(fā)光試劑與共反應(yīng)試劑均是通過分子間的相互作用實(shí)

7、現(xiàn)的。然而，這種分子間的作用通常伴有較大的能量損失，限制了發(fā)光強(qiáng)度的提高。鑒于此，本研究將發(fā)光試劑羧基化聯(lián)吡啶釕（Ru）與共反應(yīng)試劑聚酰胺-胺（PAMAM）樹狀分子交聯(lián)形成新型自增強(qiáng)型ECL衍生物（PAMAM-Ru）。該ECL衍生物通過發(fā)光基團(tuán)與共反應(yīng)基團(tuán)分子內(nèi)的相互作用及能量傳遞，縮短了作用距離、減少了能量損失，極大地提高了發(fā)光效率及穩(wěn)定性。以綠色合成的、且具有較大比表面積及電催化性質(zhì)的線狀鈀納米材料為支撐固載該ECL衍生物并標(biāo)記二抗

8、蛋白，構(gòu)建信號增強(qiáng)型的ECL免疫傳感器，成功實(shí)現(xiàn)了對癌胚抗原（CEA）的靈敏檢測。該方法所合成的新型自增強(qiáng)型的ECL衍生物具有更高的發(fā)光效率及穩(wěn)定性，為ECL技術(shù)更好地應(yīng)用于臨床分析提供了可能。
　　4.基于生長在鈀納米籠上的聚合鏈構(gòu)建自增強(qiáng)型電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的研究
　　在自增強(qiáng)型ECL衍生物的合成中，我們通過聚合反應(yīng)極大地增加了發(fā)光基團(tuán)的含量，進(jìn)一步顯著提高了發(fā)光效率。即以內(nèi)部空虛外部多孔的鈀納米籠結(jié)構(gòu)（PdNCs）

9、為支撐固載大量的共反應(yīng)試劑聚乙烯亞胺（PEI），并通過原子自由基聚合反應(yīng)在PEI上原位生長含發(fā)光基團(tuán)Ru(II)配合物的聚合鏈，得到自增強(qiáng)型ECL復(fù)合物（PdNCs-PEI-PSRu）。該復(fù)合物通過發(fā)光基團(tuán)與共反應(yīng)基團(tuán)分子內(nèi)的相互作用，縮短了反應(yīng)距離、減少了能量損失，提高了發(fā)光效率及穩(wěn)定性。并且，通過原子自由基聚合反應(yīng)提高了該復(fù)合物中發(fā)光基團(tuán)Ru(II)配合物的固載量，更有效地增加了ECL強(qiáng)度。以所制得的復(fù)合物標(biāo)記二抗并作為信號探針，并

10、用金納米顆粒功能化的石墨烯作為基底，構(gòu)建了夾心型的、用于檢測糖類抗原15-3（CA15-3）的ECL免疫傳感器。其線性范圍為0.01 U mL-1~120 U mL-1，檢測限為0.003 U mL-1。
　　5.以自增強(qiáng)型釕(II)配合物納米棒作為電致化學(xué)發(fā)光材料構(gòu)建免疫傳感器的研究
　　本研究首次直接以所合成的自增強(qiáng)型釕(II)配合物發(fā)光試劑為前體，通過溶劑蒸發(fā)誘導(dǎo)的自成核作用合成了具有極高發(fā)光效率的棒狀納米材料。該發(fā)光

11、材料的合成簡便、有效，且具有以下優(yōu)點(diǎn)：首先，自增強(qiáng)型釕(II)配合物前體通過發(fā)光基團(tuán)與共反應(yīng)基團(tuán)的分子內(nèi)電子及能量傳遞，具有很高的發(fā)光效率；其次，經(jīng)自成核形成棒狀納米材料后，該釕(II)配合物的固載量明顯增加，發(fā)光效率進(jìn)一步提高；另外，由于該納米棒帶正電荷并含氨基基團(tuán)，使得該材料易于功能化。為增強(qiáng)其導(dǎo)電性，研究中將帶負(fù)電性的鉑納米粒子吸附在其表面并標(biāo)記二抗作為信號探針，通過夾心免疫反應(yīng)構(gòu)建信號增強(qiáng)型免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)了對糖尿病腎病標(biāo)志物N