基于電致化學(xué)發(fā)光技術(shù)的納米生物傳感器的設(shè)計與研究.pdf

1、隨著科學(xué)家們逐漸揭開疾病的機理,并將其用于疾病的醫(yī)療診斷和治療之中,對特定序列的DNA,相關(guān)蛋白、酶及生物活性小分子的檢測日益受到重視。在傳統(tǒng)的分析方法中,核酸與蛋白質(zhì)的研究都采用放射性標(biāo)記、凝膠電泳和放射性自顯影等技術(shù)。這些方法過程復(fù)雜,周期長,特別是放射性標(biāo)記,存在放射性污染。而非放射性標(biāo)記法如熒光、化學(xué)發(fā)光和生物素標(biāo)記法,標(biāo)記過程繁瑣、復(fù)雜,難以實現(xiàn)自動化且儀器價格昂貴。而生命科學(xué)的迅速、深入發(fā)展迫切需要新的手段和方法,以更靈敏、

2、更真實、更快速地研究生命過程。 電致化學(xué)發(fā)光(ECL),是由電化學(xué)反應(yīng)直接或間接引發(fā)的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象,是電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光相結(jié)合的產(chǎn)物,兼具二者的優(yōu)點。其方便快捷、靈敏度高、動力學(xué)響應(yīng)范圍寬、檢出限低、可控性與選擇性好、容易實現(xiàn)實時化和集成化,可進(jìn)行原位檢測。集以上優(yōu)點于一身的電致化學(xué)發(fā)光技術(shù)近幾年在分析化學(xué),尤其在生物分析領(lǐng)域的應(yīng)用引起了人們的極大關(guān)注,為生命科學(xué)進(jìn)入到分子水平領(lǐng)域提供了有力的研究手段與方法。 當(dāng)物質(zhì)小到納

3、米數(shù)量級時,會產(chǎn)生獨特的表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等,其電學(xué)、磁學(xué)、光學(xué)和化學(xué)性質(zhì)也相應(yīng)地發(fā)生顯著的變化,呈現(xiàn)出常規(guī)材料不具備的優(yōu)越性能。因此,納米材料在催化、電子材料、微器件、增強材料及傳感器材料等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。電化學(xué)過程與電極材料的表面性質(zhì)有關(guān),如果將納米材料修飾在電極的表面,基于其比表面積大、催化活性高、親和力強的特性,其能活化電極表面,增大電流響應(yīng),降低檢測限,大大提高檢測的靈敏度,同時最大限度

4、地保持相關(guān)生物分子的生物活性。將納米技術(shù)應(yīng)用于生物活性分子的電致化學(xué)發(fā)光分析研究,是一個嶄新的領(lǐng)域,有利于創(chuàng)新性地建立一些新理論、新技術(shù)和新方法。本論文將納米技術(shù)、生物分子識別元件的特異性及電致化學(xué)發(fā)光技術(shù)的靈敏性相結(jié)合,發(fā)展具有高靈敏度和高選擇性的DNA、蛋白質(zhì)及酶的新型納米生物傳感器。開拓生物傳感器在后基因時代的研究領(lǐng)域,為研究多種生物分子提供新的手段與方法。論文分五個部分,共八章,具體內(nèi)容如下： Ⅰ.緒論(第一章)本章系統(tǒng)

5、闡述了電致化學(xué)發(fā)光的原理和特點,重點介紹了ECL兩大發(fā)光體系的反應(yīng)機理及其在分析中的應(yīng)用。介紹了DNA與核酸適配體電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器的構(gòu)造原理、分類特點及研究進(jìn)展。介紹了各種納米材料在電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器中的應(yīng)用。最后闡述了本論文的目的和意義,指出論文的創(chuàng)新之處及主要研究內(nèi)容。 Ⅱ.基于Ru(bpy)32+-SiO2 NPs的核酸適配體傳感器實現(xiàn)凝血酶蛋白質(zhì)電致化學(xué)發(fā)光特異性檢測(第二、三章)第二章基于Ru(bpy)32+

6、-SiO2 NPs的單核酸適配體傳感器經(jīng)目標(biāo)誘導(dǎo)靶替換實現(xiàn)凝血酶蛋白質(zhì)特異性檢測利用反相微乳法合成了SiO2包裹的電致化學(xué)發(fā)光活性物2,2’-聯(lián)吡啶釕(Ru(bpy)32+)納米顆粒(Ru(bpy)32+-SiO2 NPs),以此作為DNA標(biāo)記物,結(jié)合替換反應(yīng)發(fā)展了一種簡單有效的凝血酶蛋白質(zhì)電致化學(xué)發(fā)光特異性檢測的方法。首先,在金電極的表面組裝凝血酶核酸適配體aptamer,將其與標(biāo)記有Ru(bpy)32+-SiO2NPs并與aptam

7、er部分序列完全互補的ssDNA探針進(jìn)行雜交,測得第一個ECL信號(IECL1)。然后將電極與凝血酶蛋白進(jìn)行培育,凝血酶與aptamer特異性結(jié)合,將探針替換下來,此時測得第二個ECL信號(IECL2)。利用前后兩個ECL信號的差值△IEcL(IECL1-IECL2)來定量測定凝血酶。非特異性識別的蛋白不干擾測定,凝血酶在1.0×10-14 mol/L～1.0×10-11mol/L范圍內(nèi)有良好的線性響應(yīng),檢測限為1.0×10-15mol

8、/L(S/N-3,n=11)。方法可應(yīng)用于實際血漿中凝血酶的檢測。第三章基于Ru(bpy)32+-SiO2 NPs的核酸適配體傳感器經(jīng)三明治傳感系統(tǒng)實現(xiàn)凝血酶蛋白質(zhì)特異性檢測利用凝血酶的兩段核酸適配體(aptamer I,aptamer II)與凝血酶的高親和識別作用結(jié)合電致化學(xué)發(fā)光技術(shù)設(shè)計了一種具有高靈敏度和高選擇性的蛋白質(zhì)生物傳感器。將一段15個堿基的aptamerI通過Au-S鍵自組裝到金電極表面,形成生物識別層,特異性“捕捉”目

9、標(biāo)蛋白質(zhì)-凝血酶,進(jìn)而結(jié)合另一段標(biāo)記有Ru(bpy)32+-SiO2NPs的29個堿基的aptamerII探針構(gòu)建三明治結(jié)構(gòu),在含有TPrA的檢測液中通過檢測gu(bpy)32+的ECL信號對凝血酶進(jìn)行定量檢測。此傳感器對非特異性識別的蛋白如牛血清白蛋白、牛血紅蛋白不產(chǎn)生ECL響應(yīng),凝血酶在2.0×10-15 mol/L～2.0×10-12 mol/L范圍內(nèi)有良好的線性響應(yīng),檢測限為1.0×10-15mol/L(S/N=3,n=11)。

10、 Ⅲ.基于二茂鐵標(biāo)記分子燈塔構(gòu)象變化的可控固相Ru(bpy)32+-電致化學(xué)發(fā)光膜及其特異性識別DNA、蛋白質(zhì)及連接酶(第四、五和六章)第四章基于二茂鐵標(biāo)記分子燈塔構(gòu)象變化的可控固相Ru(bpy)32+-電致化學(xué)發(fā)光膜及其特異性識別DNA的研究基于二茂鐵(Fc)對電致化學(xué)發(fā)光活性物Ru(bpy)32+的ECL的高效猝滅作用發(fā)展了一種可控的固相Ru(bpy)32+-ECL膜。修飾電極的ECL強度與Fc和固定在電極表面的Ru(bpy

11、)32+的距離直接相關(guān),這個距離由標(biāo)記有Fc的分子燈塔(Fc-MB)的構(gòu)象控制。我們嘗試通過不同的途徑改變Fc-MB的構(gòu)象。Fc-MB與其環(huán)部堿基互補的DNA雜交,或者升溫將Fc-MB及雜交得到的dsDNA解旋變性,都可以很好的改變Fc-MB的構(gòu)象,進(jìn)而改變修飾電極的ECL強度。系統(tǒng)研究了溫度誘導(dǎo)二茂鐵標(biāo)記分子燈塔及其系列雜交產(chǎn)物的構(gòu)象轉(zhuǎn)變過程,成功預(yù)言了相關(guān)生物分子的熔化溫度。為深入研究分子燈塔鍵合平衡常數(shù)和莖環(huán)構(gòu)象的熱力學(xué)參數(shù)提供了

12、一種新思路。同時,此固相Ru(bpy)32+-ECL膜可以特異性、高靈敏的測定靶DNA。 第五章基于二茂鐵標(biāo)記分子燈塔適配體的固相電致化學(xué)發(fā)光傳感器特異性識別凝血酶蛋白質(zhì)通過納米金膠將Ru(bpy)32+固定,利用二茂鐵對Ru(bpy)32+的電致化學(xué)發(fā)光的高效猝滅,結(jié)合分子燈塔適配體的特殊莖環(huán)結(jié)構(gòu)建立一種高靈敏的固相電致化學(xué)發(fā)光檢測凝血酶的方法。通過凝血酶與燈塔環(huán)部核酸適配體的特異性結(jié)合來調(diào)整分子燈塔適配體的構(gòu)象,即打開燈塔的

13、莖部互補堿基對,改變Fc與固定在電極上的Ru(bpy)32+的距離,通過調(diào)整前后修飾電極ECL信號的差值(△IECL)來定量測定凝血酶。非特異性識別的蛋白不干擾測定,凝血酶在1.0×10-14 mol/L～1.0×10-11mol/L范圍內(nèi)有良好的線性響應(yīng),檢測限為1.0×10-15mol/L(S/N=3,n=11),并應(yīng)用于混合蛋白樣品的檢測。第六章基于二茂鐵標(biāo)記分子燈塔的固相電致化學(xué)發(fā)光傳感器特異性識別T4DNA連接酶利用二茂鐵對R

14、u(bpy)32+的電致化學(xué)發(fā)光的高效猝滅,結(jié)合分子燈塔的特殊莖環(huán)結(jié)構(gòu)及核酸連接的模板建立一種高靈敏的固相電致化學(xué)發(fā)光檢測T4 DNA連接酶的方法。通過T4 DNA.連接酶連接修復(fù)與Fc標(biāo)記的分子燈塔(Fc-MB)兩端環(huán)部堿基完全互補的兩條短鏈DNA,形成與Fc-MB完全互補的長鏈DNA,將Fc-MB的莖部互補堿基對徹底打開,改變Fc與固定在電極上的Ru(bpy)32+的距離,引起修飾電極的ECL信號的改變,通過前后ECL信號的差值(△

15、IECL)來定量測定T4DNA連接酶。該酶傳感器具有高的靈敏度和選擇性,對T4 DNA連接酶在5.0x10-3U/μL～5.0×10-6U/μL范圍內(nèi)有良好的線性響應(yīng),檢測限為2.5×10-6 UμL(S/N=3,n=11)。 IV.基于核酸適配體構(gòu)象轉(zhuǎn)換應(yīng)用固相電致化學(xué)發(fā)光傳感平臺超靈敏檢測腺苷(第七章)基于腺苷-核酸適配體構(gòu)象轉(zhuǎn)換機制研制出一種高靈敏的固相電致化學(xué)發(fā)光檢測腺苷的新型傳感系統(tǒng)。把對Ru(bpy)32+的電致化學(xué)

16、發(fā)光有高效猝滅作用的二茂鐵分子標(biāo)記在腺苷-核酸適配體上,腺苷-核酸適配體與腺苷特異性結(jié)合后,其構(gòu)象會發(fā)生變化,引起標(biāo)記物Fc與Ru(bpy)32+的距離變化,進(jìn)而使得修飾電極的ECL信號發(fā)生變化,通過腺苷-核酸適配體構(gòu)象轉(zhuǎn)換前后修飾電極的ECL信號的差值來定量測定小分子腺苷。非特異性識別的其它小分子不干擾測定,腺苷在1.0×10-8mol/L～1.0×10-5mol/L范圍內(nèi)有良好的線性響應(yīng),檢測限為5.0x10-9mol/L(S/N=

17、3,n=11)?；厥赵囼灲Y(jié)果滿意。簡易、快速、低耗及良好的響應(yīng)性能使本傳感系統(tǒng)在構(gòu)建基于核酸適配體傳感器檢測小分子的研究方法中體現(xiàn)出較好的發(fā)展前景。Ⅴ.應(yīng)用 MWNTs-Ru(bpy)32+混聚體經(jīng)酶放大電致化學(xué)發(fā)光特異性識別p53基因(第八章)嘗試通過多壁羧基化的碳納米管(COOH-MWNTs)將Ru(bpy)32+固定,經(jīng)吡咯膜(PPy)把MWNTs-Ru(bpy)32+混聚體與納米金膠標(biāo)記的DNA分析物相連,將葡萄糖脫氫酶參與的專