多色熒光微流控芯片電泳儀檢測(cè)光路設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn).pdf

1、微流控芯片電泳是一種通過(guò)采用微加工技術(shù)，在基片材料上制作出電泳微流通道結(jié)構(gòu)及其它配套功能單元，以實(shí)現(xiàn)集微量樣品快速分離、準(zhǔn)確檢測(cè)于一體的高效低耗的微型電泳分析實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。微流控芯片電泳一般以熒光標(biāo)記樣品，在電泳過(guò)程中完成分離和檢測(cè)，因此熒光檢測(cè)裝置是微流控芯片電泳系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分。
　　傳統(tǒng)的微流控芯片電泳熒光檢測(cè)裝置有多種不同的檢測(cè)形式，最為常見(jiàn)的系統(tǒng)采用落射熒光結(jié)構(gòu)，配合二向色鏡、濾色片多級(jí)分光，并以光電倍增管(PMT)作

2、為檢測(cè)傳感器，這類系統(tǒng)雖然能夠?qū)崿F(xiàn)較高的信噪比與時(shí)間分辨率，但其系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，成本通常較高，尤其是當(dāng)檢測(cè)熒光波長(zhǎng)眾多時(shí)，系統(tǒng)成本將隨熒光種類的增加成倍增加。文獻(xiàn)也有報(bào)道采用光柵作為色散元件，以定制加工的雪崩二極管(APD)為傳感器的檢測(cè)系統(tǒng)，雖然APD的高靈敏度能夠彌補(bǔ)光柵作為色散元件的低透過(guò)率，但定制加工元件的成本非常高，且加工條件苛刻，不適合相應(yīng)儀器的開(kāi)發(fā)。與此同時(shí)，電荷耦合元件(CCD)作為一種越發(fā)常見(jiàn)的光電傳感器，正在被廣泛應(yīng)用

3、于各類檢測(cè)領(lǐng)域，高質(zhì)量CCD不僅可以用于生物領(lǐng)域的成像，也可以用于各類熒光、化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)，但CCD靈敏度一般不及PMT、APD高。為了同時(shí)兼顧微流控芯片電泳熒光檢測(cè)系統(tǒng)的成本與檢測(cè)靈敏度，本文設(shè)計(jì)并實(shí)現(xiàn)了一套以三棱鏡作為色散元件配合CCD作為感光器件的檢測(cè)系統(tǒng)，三棱鏡的高通光率能夠彌補(bǔ)CCD靈敏度的不足，同時(shí)也避免了多級(jí)二向色鏡、濾光片系統(tǒng)的復(fù)雜性與高成本，有效地實(shí)現(xiàn)了多波長(zhǎng)熒光的同步檢測(cè)分離。本文的具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　(1

4、)本文以三棱鏡為色散元件進(jìn)行Zemax仿真，研究了不同的光線入射角以及不同的棱鏡頂角對(duì)棱鏡線色散率的影響。仿真結(jié)果顯示棱鏡入射角從0°增加至最小偏向角對(duì)應(yīng)的入射角時(shí)，線色散率減小;棱鏡頂角增加，線色散率增加，仿真結(jié)果也從理論上說(shuō)明了采用棱鏡作為色散元件的可行性。
　　(2)本文設(shè)計(jì)了激光誘導(dǎo)的微流控芯片電泳多色熒光檢測(cè)光路的結(jié)構(gòu)圖，詳述了光路搭建過(guò)程中所采用的各類調(diào)試方法;調(diào)試后的系統(tǒng)能夠穩(wěn)定地獲得色散的光譜圖像;并以此為基礎(chǔ)，確

5、定選用光譜圖像中高度為35像素矩形圖像區(qū)進(jìn)行光譜曲線轉(zhuǎn)換較為合適;本文同時(shí)測(cè)定了10-7 mol/L、10-8 mol/L、10-9 mol/L標(biāo)準(zhǔn)熒光素鈉樣品溶液下，采集光譜信號(hào)的信噪比(SNR)與信背比(SBR)，結(jié)果顯示當(dāng)選用0.1s曝光時(shí)間時(shí)，系統(tǒng)半峰寬SNR為20.961 dB，信背比SBR為0.438，理論上信號(hào)可用于有效的光譜分析;本文還測(cè)定了不同濃度熒光素鈉樣品溶液在當(dāng)前的激光強(qiáng)度下的熒光漂白情況，結(jié)果顯示低濃度的漂白情

6、況較為嚴(yán)重。
　　(3)本文選擇波長(zhǎng)掃描法對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行了光譜標(biāo)定，實(shí)驗(yàn)考察了不同的峰值定位方法與不同的標(biāo)定擬合函數(shù)的標(biāo)定效果，綜合分析了汞燈原子譜線與單色儀隨機(jī)譜線的測(cè)量誤差以及曲線擬合殘差結(jié)果，本系統(tǒng)最終選用質(zhì)心法作為峰值定位算法，并配合三階多項(xiàng)式進(jìn)行擬合，標(biāo)定后的系統(tǒng)測(cè)量精度較高，測(cè)試偏差約0.947 nm。根據(jù)標(biāo)定的結(jié)果，結(jié)合本系統(tǒng)采集的低壓汞燈光譜曲線數(shù)據(jù)，本文計(jì)算出了系統(tǒng)在汞燈的546.074 nm譜線處的分辨率為4.59

7、7 nm，在576.960 nm與579.066 nm譜線處的分辨率為6.119 nm，理論上本系統(tǒng)能夠區(qū)分出電泳所采用的四種熒光染料。
　　(4)染料靜態(tài)實(shí)驗(yàn)測(cè)試了電泳所用的四種不同染料在10-7mol/L，10-8 mol/L濃度時(shí)，系統(tǒng)采集信號(hào)的信噪比、信背比，結(jié)果顯示6-FAM染料由于熒光波長(zhǎng)受當(dāng)前截止濾光片的影響，在本系統(tǒng)的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度較弱。其他三種染料的信噪比與信背比一般呈現(xiàn)如下趨勢(shì):HEX＞TAMRA＞ROX;相對(duì)于

8、熒光素鈉，三種染料的信號(hào)強(qiáng)度均較弱。
　　(5)本文提出了基于超定方程的最小二乘解的熒光矯正算法，用于矯正多種熒光同時(shí)經(jīng)過(guò)檢測(cè)窗口的光譜曲線，混合熒光溶液靜態(tài)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該算法在不同濃度、不同曝光時(shí)間下的矯正系數(shù)與預(yù)期基本一致，矯正參數(shù)還原出的光譜擬合曲線與原始采集的光譜曲線在峰內(nèi)基本重合。
　　(6)本文進(jìn)行了微流控芯片電泳實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了三種不同染料在電泳過(guò)程中通過(guò)檢測(cè)窗口的檢測(cè)效果，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)電泳過(guò)程中電泳膠內(nèi)含有不屬于上述