孟德爾遺傳易感分枝桿菌病篩查方法的建立與應用.pdf

1、第一部分孟德爾遺傳易感分枝桿菌病篩查方法的建立
　　目的:
　　1.建立Q-RT-PCR檢測IL-12/23-IFN-γ通路完整性的功能試驗。
　　2.建立流式細胞術檢測IL-12RB1和IFN-γR1蛋白表達的方法。
　　方法:
　　1.正常人全血用RPMI1640稀釋后，加不同濃度的BCG（空白，2.5 ug/ml,0.25ug/ml，0.0250 ug/ml，0.0025 ug/ml）刺激培養(yǎng)48h后

2、，Q-RT-PCR檢測IFN-γ的mRNA水平，用不同全血標本重復三次。
　　2.正常人全血用RPMI1640稀釋后，加BCG及不同濃度的IL-12P70（空白，40ng/ml，20ng/ml，10ng/ml，5ng/ml）刺激培養(yǎng)48h后，Q-RT-PCR檢測IFN-γ的mRNA水平，用不同的全血標本重復三次。
　　3.正常人全血用RPMI1640稀釋后，加BCG及不同濃度的IFN-γ(空白，10000U/ml，5000U

3、/ml，2500U/ml，1250U/ml)刺激培養(yǎng)48h后，Q-RT-PCR檢測IL-12B mRNA的水平，用不同的全血標本重復三次。
　　4.提取正常人的PBMC，于37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中用PHA(5ug/ml)分別刺激培養(yǎng)24，48h和88h，流式細胞術檢測IL-12RB1和IFN-γR1蛋白的表達。
　　結果:
　　1.檢測IL-12/23-IFN-γ軸完整性的功能試驗的最佳刺激條件如下:
　　1

4、)無刺激組;2）只加BCG（0.25ug/ml）組;3)BCG（0.25ug/ml）+IL-12P70(20ng/ml);4)BCG(0.25ug/ml)+IFN-γ(2500U/ml)。
　　2.PHA（5ug/ml）刺激88h作為流式細胞術檢測IL-12RB1和IFN-γR1最佳刺激條件。
　　結論:
　　本研究初步建立了Q-RT-PCR檢測IL-12/23-IFN-γ軸完整性的功能試驗，同時建立了流式細胞術檢測I

5、L-12RB1和IFN-γR1蛋白表達的方法，兩種方法結合可以快速的篩查MSMD的疑似患者。
　　第二部分卡介苗接種異常反應患兒孟德爾遺傳易感分枝桿菌病的篩查
　　目的:
　　對卡介苗接種異常反應的12例患兒進行孟德爾遺傳易感分枝桿菌病的篩查。
　　方法:
　　1.收集整理12例卡介苗接種異常反應患兒的臨床及實驗室檢查資料。
　　2.Q-RT-PCR檢測12例患兒IL-12/23-IFN-γ通路的完整

6、性。
　　3.流式細胞術檢測9例患兒IL-12RB1和IFN-γR1蛋白的表達。
　　4.RT-PCR/PCR直接測序分析IL12RB1和IFNGR1基因。
　　結果:
　　1.臨床特征及實驗室檢查
　　本組12例患兒，7男5女，均以接種卡介苗后出現(xiàn)淋巴結炎為主要就診原因，9例患兒有其他病史，7例患兒有可疑家族史。患兒平均起病年齡為6.03 m，平均篩查年齡19.77 m。目前，2例死亡（例3和例9）。

7、r>　　10例患兒淋巴結活檢結果均顯示結核。5例患兒胸部CT存在異常。
　　2.12例均進行了IL-12/23-IFN-γ通路完整性的檢測。患兒1，3，9和10存在異常。
　　3.例4和9細胞表面未檢測到IL-12RB1蛋白的表達。
　　4.例3存在IFNGR1基因突變，例10為STAT1基因突變。
　　結論:
　　接種卡介苗后出現(xiàn)局部淋巴結炎是本組患兒的主要臨床表現(xiàn)，最常見的部位是同側腋窩淋巴結。例3存在

8、IFNGR1基因突變，確診為MSMD。例10存在AD STAT1增強性突變，診斷為CMC。
　　第三部分干擾素γ受體1缺陷的臨床特征及功能、基因分析
　　目的:
　　探討1例疑似孟德爾遺傳易感分枝桿菌病(MSMD)患兒的臨床特征、檢測IL-12/23-IFN-γ通路的完整性，并進行干擾素γ受體1(IFN-γR1)基因分析，提高兒科醫(yī)生對本病的認識。
　　方法:
　　1.根據(jù)患兒的臨床表現(xiàn)及常規(guī)免疫學篩查試驗

9、，排除常見原發(fā)性免疫缺陷病。
　　2.Q-RT-PCR在mRNA水平檢測患兒及健康對照IL-12/23-IFN-γ通路的完整性。
　　3.通過PCR及RT-PCR直接測序分別對患兒和其父母的IFNGRI基因進行擴增并測序。
　　結果:
　　1.臨床特征:
　　患兒，女，11月，因“面色蒼白、間斷咳嗽4月，進行性加重2天”入住我院。以貧血為主要表現(xiàn)，無出血及溶血表現(xiàn);無皮疹、骨及關節(jié)腫脹。有播散性卡介苗(BC

10、G)病。四肢長骨X線及胸腹聯(lián)合CT見全身多發(fā)骨質破壞。
　　2.患兒NBT，血清免疫球蛋白，淋巴細胞亞群，白細胞呼吸爆發(fā)試驗和CD18的檢測均正常。
　　3.患兒的全血用BCG和IFN-γ共同刺激48h后IL-12B的表達量與單獨BCG刺激后比較明顯降低，而健康對照者表達量增加。
　　4.基因測序發(fā)現(xiàn)患兒IFNGR1第6外顯子雜合缺失突變(c.818-821delTTAA，p.Asn274fsX276)，父母此位點正常