丙酮丁醇高產(chǎn)菌株選育及發(fā)酵工藝研究.pdf

1、丙酮丁醇發(fā)酵作為一項傳統(tǒng)的發(fā)酵曾經(jīng)僅次于酒精發(fā)酵是世界第二大發(fā)酵。在上世紀(jì)五十年代，丙酮丁醇發(fā)酵逐漸被迅速發(fā)展的石油化工產(chǎn)業(yè)所替代。隨著石油資源的日趨短缺，利用豐富廉價的生物質(zhì)做原料，進(jìn)行微生物發(fā)酵，生產(chǎn)石油的替代燃料已成為重點研究方向。丙酮丁醇發(fā)酵其作為一種將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成燃料和化工原料的重要手段，再度引起人們的廣泛青睞。傳統(tǒng)的丙酮丁醇發(fā)酵是糧食發(fā)酵，原料成本太高，為了降低原料成本，人們對農(nóng)作物秸稈，麩皮以及工業(yè)生產(chǎn)中的廢液廢渣等原料進(jìn)

2、行了大量深入的研究。這些原料資源豐富，價格低廉，并且利用這些資源發(fā)酵有利于保護(hù)環(huán)境。本論文以工業(yè)廢液木糖母液和玉米漿為原料，進(jìn)行丙酮丁醇發(fā)酵。但丙酮丁醇發(fā)酵溶劑產(chǎn)量低、提取成本過高，這些嚴(yán)重制約該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此通過高產(chǎn)菌株的選育、發(fā)酵工藝優(yōu)化等手段來提高溶劑產(chǎn)量是十分必要的。
　　本論文的主要研究內(nèi)容:
　　(1)產(chǎn)物檢測方法的建立
　　為丙酮丁醇發(fā)酵產(chǎn)物檢測建立了一種快速有效的方法，采用GC1690氣相色譜儀、AC

3、-20毛細(xì)管色譜柱和FID(氫火焰離子)檢測器對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行檢測。檢測條件經(jīng)過優(yōu)化后，將ABE的檢測時間縮短到4.2min，若需要檢測乙酸和丁酸兩種副產(chǎn)物的含量，每個樣品的檢測時間是8.5min。
　　以異丁醇為內(nèi)標(biāo)物，以峰面積內(nèi)標(biāo)法，對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。繪制出每種溶劑的回歸曲線，5種溶劑的回歸方程相關(guān)系數(shù)R2都大于0.99，表明As/Ai與溶劑濃度的線性相關(guān)程度好。重復(fù)性和穩(wěn)定性實驗表明溶劑檢測結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD都很小

4、。說明測定方法和儀器條件能夠快速、準(zhǔn)確的檢測發(fā)酵樣品，為篩選高產(chǎn)菌株和大規(guī)模發(fā)酵檢測提供保障。
　　(2)木糖渣的糖化和發(fā)酵
　　對木糖渣進(jìn)行預(yù)處理，酸堿處理后的糖化效果不如自來水處理的效果好。溫度對纖維素酶的酶解反應(yīng)有很大影響，在37℃、45℃和55℃條件下進(jìn)行糖化反應(yīng)，最終確定45℃為最佳糖化溫度。糖化體系中添加漆酶會抑制纖維素酶的催化反應(yīng)，降低纖維素轉(zhuǎn)化率。進(jìn)行分步糖化發(fā)酵和同步糖化發(fā)酵，結(jié)果表明同步糖化發(fā)酵溶劑產(chǎn)量更

5、高。
　　(3)高產(chǎn)菌株的選育
　　對拜氏梭菌ATCC55025（Clostridiumbeijerinckii）進(jìn)行自然選育挑選出產(chǎn)量較高的菌株L-1，并對該菌株進(jìn)行碳源和氮源實驗，確定以10％木糖母液和3.5％玉米漿為發(fā)酵培養(yǎng)基，不添加任何其他成分，降低了培養(yǎng)基的成本，簡化了培養(yǎng)基的組成。以L-1為出發(fā)菌株，對其進(jìn)行紫外誘變和低能N+注入誘變，以10％木糖母液和3.5％玉米漿為發(fā)酵培養(yǎng)對誘變菌株進(jìn)行厭氧瓶篩選。誘變后溶劑

6、產(chǎn)量有了大幅度提高。丁醇對細(xì)胞有很大的毒害作用，誘變后的菌株最高可以耐受11g/L的丁醇。
　　(4)發(fā)酵工藝的優(yōu)化
　　在厭氧瓶中進(jìn)行接種量和補(bǔ)料實驗，確定最佳接種量為5％，補(bǔ)料時間是36小時，補(bǔ)料量是15g/L。菌種在液體中連續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，負(fù)變異很快，溶劑產(chǎn)量驟減。菌種在固體中傳代4次，發(fā)酵產(chǎn)量沒有很大影響，在固體傳代中菌種性能穩(wěn)定。
　　在5L罐中進(jìn)行發(fā)酵，以總?cè)軇┊a(chǎn)量作為主要參考指標(biāo)，確定了最佳發(fā)酵工藝條件:初始