基于木質(zhì)纖維產(chǎn)丁醇高產(chǎn)菌株選育及關(guān)鍵酶基因表達(dá)分析.pdf

1、隨著全球化石能源的日漸枯竭和快速增長(zhǎng)的能源需求，能源資源約束的日益加劇和生態(tài)環(huán)境問(wèn)題的不斷突出，保障能源安全和發(fā)展綠色可再生能源已引起各國(guó)政府的高度重視。因此，利用可再生的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)來(lái)生產(chǎn)替代燃料受到了廣泛的關(guān)注。而生物丁醇作為一種能與汽油以任意比例混和使用甚至替代汽油的可再生清潔能源也迎來(lái)了全新的發(fā)展機(jī)遇。但利用木質(zhì)纖維生產(chǎn)生物丁醇目前尚存在產(chǎn)量低，原料利用率不高等難題。鑒于此，本研究從菌種的選育出發(fā)，以具有廣譜碳水化合物發(fā)酵能

2、力的糖丁基梭狀芽孢桿菌(Clostridium saccharobutylicum) ATCC BAA-117為出發(fā)菌株，將基因組改組技術(shù)與進(jìn)化工程育種相結(jié)合，進(jìn)行了適應(yīng)高濃度楊木水解液的生物丁醇高產(chǎn)菌株的選育，成功獲得了株能高效利用楊木水解液發(fā)酵高產(chǎn)丁醇的重組進(jìn)化菌株gsGD-1。同時(shí)，對(duì)選育菌株gsGD-1利用楊木水解液產(chǎn)丁醇的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，并進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)出發(fā)菌株和改組后高產(chǎn)重組進(jìn)化菌株gsGD-1之間

3、的丁醇合成酶關(guān)鍵基因表達(dá)差異進(jìn)行了分析。研究?jī)?nèi)容及取得的主要結(jié)果如下:
　　1.建立了用于基因組改組的遺傳多樣性親本菌株庫(kù)。出發(fā)菌株Clostridiumsaccharobutylicum ATCC BAA-117經(jīng)紫外誘變(UV)、核糖體工程育種技術(shù)和丁醇耐受性篩選三種方法獲得9株能穩(wěn)定遺傳的正向性狀菌株，包括丁醇產(chǎn)量高于出發(fā)菌株的突變菌6株，分別為UV-1、UV-2、UV-3、RE-1、RE-2和RE-3，其丁醇產(chǎn)量均比原始菌

4、株提高20％以上;丁醇耐受性高于出發(fā)菌株的突變株3株，分別為HBT-1、HBT-2和HBT-3，其丁醇耐受性均較原始菌株提高25％以上。這9株菌株組成基因組改組的親本菌株庫(kù)，用于后續(xù)的遞推式原生質(zhì)體融合實(shí)驗(yàn)。
　　2.獲得了Clostridium saccharobutlicum原生質(zhì)體制備、再生和融合的最佳條件。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)面分析得到親本庫(kù)菌株原生質(zhì)體制備的最優(yōu)條件為:菌培養(yǎng)時(shí)間為12h，采用溶菌酶的酶

5、濃度為7.11 mg/mL，在酶解溫度為39℃條件下，酶解處理1h，糖丁基梭狀芽孢桿菌原生質(zhì)體的制備率與再生率之積達(dá)到了50.8％;原生質(zhì)體融合的最佳條件為:PEG4000的濃度為30％、融合溫度為37℃、融合時(shí)間為20min和Ca2+濃度為45mM，融合率最高為4.9×10-5。
　　3.利用基因組改組技術(shù)選育了2株高產(chǎn)丁醇重組菌株GS3-11和GS3-255。以親本菌株庫(kù)的9株菌株進(jìn)行遞推式原生質(zhì)體融合，經(jīng)過(guò)三輪有效的基因組改

6、組，對(duì)獲得的融合子進(jìn)行了抗性平板初篩和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，獲得了2株能穩(wěn)定遺傳的高產(chǎn)和高丁醇耐受性重組菌株GS3-11和GS3-255，在3L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，丁醇的產(chǎn)量分別達(dá)到12.51 g/L和12.20g/L，均比出發(fā)菌株提高60％以上。
　　4.用進(jìn)化工程的方法篩選出一株能適應(yīng)高濃度楊木水解液的進(jìn)化菌株gsGD-1。首先確定了各菌株在不同楊木水解液濃度下的代時(shí)和篩選壓力，得出GS3-11的抗高濃度楊木水解液的能力要優(yōu)于GS3

7、-255。進(jìn)一步通過(guò)在恒定楊木水解液濃度和梯度楊木水解液濃度下對(duì)GS3-11進(jìn)行持續(xù)進(jìn)化培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)梯度楊木水解液濃度進(jìn)化篩選高濃度楊木水解液耐受性菌株效果優(yōu)于恒定楊木水解液濃度下的進(jìn)化篩選。篩選得到的進(jìn)化菌株gsGD-1在楊木水解液中還原糖濃度為60g/L條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵和3L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，其最大OD值為2.05，生物丁醇的最大產(chǎn)量為10.21g/L，比進(jìn)化篩選前菌株GS3-11的丁醇最大產(chǎn)量(3.45 g/L)提高196％。

8、>　　5.對(duì)進(jìn)化菌株gsGD-1利用楊木水解液發(fā)酵產(chǎn)丁醇的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)P-B實(shí)驗(yàn)、中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析得到gsGD-1發(fā)酵產(chǎn)生物丁醇的最優(yōu)發(fā)酵條件為:楊木水解液中還原糖濃度為52.79 g/L，(NH4)2SO43.0 g/L，酵母粉2.54 g/L，CaCO35.43g/L, KH2PO40.75g/L, K2HPO40.81 g/L, MgSO4·7H2O0.2g/L, FeSO4·7H2O0.3 g/L，MnS

9、O40.01 g/L，初始pH7.0，接種量9.7％，裝液量76.4％和發(fā)酵溫度36.5℃。在此優(yōu)化條件下發(fā)酵培養(yǎng)，菌株gsGD-1最大生物丁醇產(chǎn)量為15.64g/L，較優(yōu)化前(12.57g/L)提高了24.4％，較原始菌株(7.12 g/L)提高了120％。
　　6.對(duì)進(jìn)化菌株gsGD-1和原始菌株丁醇生物合成中關(guān)鍵酶基因的差異表達(dá)進(jìn)行了分析。以管家基因16s rRNA為內(nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)了原始菌株Clostri

10、dium saccharobutylicum ATCC BAA-117與進(jìn)化菌株gsGD-1在丁醇生物合成過(guò)程中產(chǎn)酸中期與產(chǎn)溶劑中期關(guān)鍵酶基因的表達(dá)差異。
　　2-ΔΔCt相對(duì)定量分析結(jié)果表明:
　　(1)進(jìn)化菌株的產(chǎn)酸基因ack和buk在產(chǎn)酸階段的表達(dá)量均低于原始菌株，約為原始菌株ack和buk基因表達(dá)量的65％，而在產(chǎn)溶劑階段的表達(dá)量比原始菌株要高，約為原始菌株的1.5倍。
　　(2)進(jìn)化菌株的產(chǎn)溶劑基因adhE、

11、aadc、ctfAB和bdhB的表達(dá)量在產(chǎn)酸階段，除aadc變化不明顯外，其他三個(gè)基因adhE、ctfAB和bdhB的表達(dá)量均高于原始菌株，分別為原始菌株的2.67、1.8和1.6倍;在產(chǎn)溶劑階段的表達(dá)量均高于原始菌株，分別為原始菌株的2.51、2.82、10.5和1.34倍。
　　(3)進(jìn)化菌株與丁醇耐受性相關(guān)的基因gldA在產(chǎn)酸階段的表達(dá)量約為原始菌株的40％，在產(chǎn)溶劑階段gldA的表達(dá)量仍然低于原始菌株，約為原始菌株的60％