玉米種子純度快速分子檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、種子銷售過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)侵權(quán)行為或違規(guī)經(jīng)營(yíng)行為，種子質(zhì)量越來(lái)越受到重視，其中玉米種子純度倍受關(guān)注。種子純度檢測(cè)方法有很多，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法發(fā)揮了重要作用，但是由于眾多不利因素，這些方法難以滿足快速、準(zhǔn)確的種子純度檢測(cè)需求。分子檢測(cè)技術(shù)的準(zhǔn)確性高，但是目前的檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。本研究以SSR標(biāo)記技術(shù)為基礎(chǔ)，通過(guò)DNA快速提取方法和通用多重PCR技術(shù)的研發(fā)，建立了一種玉米種子純度快速分子檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)在玉米品種保護(hù)、純度和真實(shí)性檢測(cè)方面具有重要價(jià)值

2、，對(duì)保證玉米種子質(zhì)量安全具有重要意義。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.通過(guò)DNA提取方法的研究，建立了一種基于PCR的玉米半粒種子DNA快速提取方法。研究了提取液濃度、提取液體積、提取時(shí)間對(duì)DNA完整性和PCR產(chǎn)物的影響，DNA模板量和不同公司的Mix對(duì)PCR產(chǎn)物的影響，得出DNA快速提取方法的參數(shù)范圍。將玉米種子沿胚縱切，取一半（必須含有胚）放入1.5 mL離心管中，加入200μL-1000μL提取液(0.03 M-0.2 M

3、KOH或NaOH溶液)，提取1 min-2 d，混勻提取液，混勻后的提取液即為DNA樣品，取0.5μL-5μL該DNA樣品可以直接用于PCR擴(kuò)增。
　　 2.通過(guò)多重PCR技術(shù)的研究，建立了一種通用多重PCR技術(shù)。對(duì)引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增體系和PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行研究，并驗(yàn)證該技術(shù)的可行性，得出通用多重PCR技術(shù)的實(shí)施方式。將上游引物的通用接頭序列（5’-CTCGTAGACTGCGTACCA-3’）加在上游引物的5’端，將下游引物的

4、通用接頭序列(5’-TACTCAGGACTCATCGTC-3’)加在下游引物的5’端，引物加上通用接頭后命名為通用接頭引物(U-primers)。通用多重PCR技術(shù)采用20μL擴(kuò)增體系，其中每對(duì)U-primers的上下游引物（10μM）各0.5μL，10μL2×Power Taq PCR MasterMix(BioTeke，北京，中國(guó))，2μL DNA（100 ng·μL-1或基于PCR的玉米半粒種子DNA快速提取法提取的DNA樣品），

5、用滅菌后的DEPC ddH2O補(bǔ)足20μL。通用多重PCR擴(kuò)增程序采用一種新穎的模式，命名為“兩段循環(huán)模式”:①預(yù)變性(94℃，5min)。②第一段循環(huán)（循環(huán)數(shù):3）命名為“逐一退火循環(huán)”:變性(94℃，40 s);按照未加通用接頭前的多對(duì)引物的退火溫度從高到低的順序逐一退火（在設(shè)定退火溫度時(shí)，退火溫度相近的可以合并為一個(gè)溫度），每個(gè)退火溫度的退火時(shí)間為20 s;延伸(72℃，30s)。③第二段循環(huán)（循環(huán)數(shù):28-32，通常為30）:變