藍鯊Ⅱ型膠原蛋白生物化學特性和免疫耐受特性的研究.pdf

1、海洋生物Ⅱ型膠原蛋白(typeⅡcollagen,CⅡ)是海洋生物軟骨組織的主要構成蛋白,其與皮膚或骨骼中存在的Ⅰ型膠原蛋白在氨基酸構成以及空間結構上有明顯的不同,并且結合有Ⅰ型膠原蛋白不存在的構成糖。類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種病因尚未明了的慢性全身性炎癥性疾病,以慢性、對稱性、多滑膜關節(jié)炎和關節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn),屬于自身免疫性疾病。它以關節(jié)和滑膜的炎癥及軟骨和骨的進行性破壞為特征,致殘率

2、高。已經(jīng)有資料顯示,雞或牛的CⅡ通過口服免疫耐受作用達到治療RA的作用。為此,我們深入探討了海洋生物來源的CⅡ在治療RA方面的特性,豐富了CⅡ在其應用領域的功能作用,填補了海洋生物CⅡ的研究空白。
　　第一章從口服免疫耐受對 RA的治療作用和 CⅡ在大鼠RA模型中的自我免疫作用兩個方面簡要介紹了CⅡ在RA治療中的應用。
　　第二章介紹了CⅡ的分離純化,分離CⅡ的實驗材料是新鮮的藍鯊(Prionace glauca)軟骨,采用

3、胃蛋白限制性酶解分離法。SDS-PAGE上顯示藍鯊Ⅱ型膠原蛋白(SCⅡ)是由分子量為130 kDa的α1鏈構成,另外,圖譜上無其他雜帶,說明提取得到的SCⅡ達到了電泳純。對SCⅡ常見氨基酸和羥脯氨酸的比例和含量進行了檢測。結果表明 SCⅡ的甘氨酸殘基占氨基酸殘基總數(shù)的30％以上,并且富含丙氨酸殘基和脯氨酸殘基,分別占氨基酸殘基總量的10.4%和8.8%,由制作的標準曲線推算出SCⅡ羥脯氨酸的含量為7.09%,另外,氨基酸分析過程中并無酪

4、氨酸和色氨酸檢出。
　　第三章深入分析了SCⅡ一系列的生物化學特性。分別通過差示掃描量熱法、圓二色譜法、紫外掃描法和紅外光譜法分析了SCⅡ的熱變性溫度、二級結構特征、紫外吸收特性和紅外光譜特征。差示掃描量熱儀的檢測結果顯示SCⅡ的熱變性溫度為40.5℃,并通過實驗證明了鹽濃度和氫離子濃度對其熱變性溫度有著重要的影響。采用圓二色光譜研究SCⅡ的二級結構特征,計算出了SCⅡ二級結構的組成和比例,并深入探討了氫離子濃度和保溫時間對SCⅡ

5、二級結構組成和比例的影響,發(fā)現(xiàn)這二者對 SCⅡ的二級結構有著極大的影響。紫外掃描法顯示,SCⅡ在260nm處有最大的紫外吸收。紅外光譜實驗結果顯示SCⅡ最主要的吸收帶在酰胺帶處,包括酰胺Ⅰ(1649-1658cm-1)、酰胺Ⅱ(1551-1557cm-1)、酰胺Ⅲ(1239-1245cm-1)、酰胺A(3407-3425cm-1)和酰胺B(2932-2961cm-1)。
　　第四章介紹了在堿性條件下將FITC標記到SCⅡ上,獲得了

6、FITC-SCⅡ復合物,并通過SDS-PAGE對標記結果進行驗證。熒光及白光成像相結果相對比后發(fā)現(xiàn),FITC成功的標記到了SCⅡ上,且熒光成像結果表明復合物熒光強度較強,說明FITC-SCⅡ復合物結合牢固,性質穩(wěn)定。
　　第五章介紹的是 SCⅡ對 CD8+T細胞生長狀況的影響。我們將結合成功的FITC-SCⅡ復合物用細胞培養(yǎng)液配制成11.1μg/mL,5.56μg/mL,3.33μg/mL和1.11μg/mL四個濃度梯度,與CD8

7、+T細胞在37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,培養(yǎng)結束后于熒光倒置顯微鏡下拍照。結果顯示,FITC-SCⅡ復合物與CD8+T細胞表面的特異性受體發(fā)生了特異性結合。隨后我們又探討了SCⅡ與CD8+T細胞表面的受體發(fā)生特異性結合后對細胞活性和功能的影響,發(fā)現(xiàn)CⅡ作為一種營養(yǎng)物質促進了CD8+T細胞的生長,但它同時也可令CD8+T細胞發(fā)生僵化作用,激活CD8+T抗原受體信號轉導下游通路,產(chǎn)生較多的細胞凋亡因子Fas。
　　第六章通

8、過建立動物模型來驗證口服CⅡ產(chǎn)生免疫耐受治療RA的效果,并探討其治療機理。首先,我們按照1mg/Kg/d和3mg/Kg/d的劑量對大鼠灌服CⅡ,并設置空白組、陰性對照組(灌服TWP)和陽性對照組(灌服乙酸),連續(xù)灌胃15天后,用0.1ml完全弗氏佐劑(CFA)于實驗組右后足墊處注射致炎,在隨后的30天內通過大鼠的臨床癥狀表現(xiàn)來評價關節(jié)炎指標,最后將大鼠處死取靜脈血, ELISA法檢測其血清中抗CⅡ抗體、IL-10、IFN-γ和TNF-α