納米傳感界面的構(gòu)建及其生物分析檢測(cè)研究.pdf

1、對(duì)抗原與抗體、酶與底物分子、糖分子與特定蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行研究，對(duì)影響細(xì)胞功能的生物分子進(jìn)行檢測(cè)是生物分析領(lǐng)域的重要研究?jī)?nèi)容，為人們獲取生命相關(guān)過(guò)程的化學(xué)和生物信息、診斷疾病、研究致病機(jī)理提供了信息和技術(shù)支持。生物傳感器是進(jìn)行生物分析的有力工具，然而生物體系的復(fù)雜性、不穩(wěn)定性要求科研工作者們?cè)O(shè)計(jì)并建立穩(wěn)定性更好、靈敏度更高、選擇性更專一的生物傳感器。納米材料因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)而具優(yōu)良的物理、化學(xué)等性能，是構(gòu)建生物傳感界面的優(yōu)良材料。將納米

2、材料用于生物傳感界面的構(gòu)建，可以使生物傳感器的靈敏度、穩(wěn)定性和選擇性等分析性能得到極大的提升，是生物傳感器研究的新熱點(diǎn)。本論文將磁性納米粒子、金納米粒子、氧化石墨烯及它們的復(fù)合物用于電化學(xué)和表面等離子體共振(SPR)傳感界面的構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)和DNA的高靈敏和高選擇性檢測(cè)。主要工作概括如下：
　　1、以 Fe3O4磁性納米粒子為載體、多巴胺(DA)為功能單體、血紅蛋白(Hb)為模板分子，用氯鉑酸氧化DA生成聚多巴胺(PDA)，同

3、時(shí)氯鉑酸還原為鉑納米粒子(Pt NPs)，與Hb一起負(fù)載于Fe3O4納米粒子表面，洗脫Hb后，合成了表面分子印跡磁性納米粒子(印跡Fe3O4/PDA-Pt NPs)。將印跡Fe3O4/PDA-Pt NPs修飾于磁性玻碳基底表面，制得印跡Fe3O4/PDA-Pt NPs修飾電極。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，印跡Fe3O4/PDA-Pt NPs具有良好的水溶性，粒徑分布均勻，生成的Pt NPs具有良好的剛性和導(dǎo)電性。用印跡Fe3O4/PDA-Pt NPs

4、構(gòu)建的傳感器對(duì)Hb具有良好的識(shí)別性,在0.14~2.7μg/mL Hb濃度范圍與交流阻抗變化值呈良好的線性關(guān)系，檢出限(S/N=3)為0.05μg/mL。
　　2、以刀豆蛋白A(ConA)作為模板蛋白，構(gòu)建了一種高靈敏檢測(cè)ConA的SPR傳感器。我們使用一步法合成了右旋糖苷包裹金納米粒子(Dex-Au NPs)，并用于信號(hào)放大。將苯環(huán)化的右旋糖苷(DexP)通過(guò)π-π作用組裝到氧化石墨烯(GO)修飾的SPR金片表面，形成GO/De

5、xP傳感界面。由于ConA和右旋糖苷能發(fā)生特異性結(jié)合，該傳感界面可以特異結(jié)合ConA，進(jìn)而將Dex-Au NPs連接到傳感界面，形成夾心結(jié)構(gòu)DexP/ConA/Dex-Au NPs。我們用電子掃描顯微鏡、電化學(xué)阻抗以及循環(huán)伏安對(duì)界面形貌和電化學(xué)性能進(jìn)行了表征。由于GO有很大的比表面積，Dex-Au NPs對(duì)SPR信號(hào)有很好的放大作用，該夾心型SPR傳感器可以靈敏地檢測(cè)ConA，線性范圍為1.0~20.0μg/mL，檢測(cè)限為0.39μg/

6、mL，比直接法檢測(cè)ConA的靈敏度提高了28.7倍。該傳感器的構(gòu)建方法為高靈敏度、高選擇性檢測(cè)生物分子的SPR傳感器設(shè)計(jì)提供了新的方向。
　　3、基于λ核酸外切酶(λ-Exo)的DNA循環(huán)和HCR擴(kuò)增的多重放大策略及原位生成PANI對(duì)信號(hào)的放大作用，建立了SPR檢測(cè)高致病性禽流感病毒H5N1基因片段的方法。靈敏度的顯著提高來(lái)源于三個(gè)方面：(1)通過(guò) HCR的擴(kuò)增作用生成長(zhǎng)的切口 DNA雙鏈，每個(gè)切口處均可形成 G-四鏈體，G-四鏈

7、體再與Hemin結(jié)合生成G4/Hemin；(2) G4/Hemin具有HRP模擬酶的作用，能催化H2O2氧化苯胺生成聚苯胺(PANI)。PANI在SPR金膜表面沉積下來(lái)，引起SPR信號(hào)的增強(qiáng)；(3)捕獲DNA(CP)的3?端和5?端分別修飾了巰基和磷酸根，可以固定在SPR金片上。與目標(biāo)DNA(H5N1)雜交后,λ-Exo將CP剪切重新釋放出H5N1，使H5N1得到循環(huán)利用。該方法的檢測(cè)限為0.27 pM，與基于HCR擴(kuò)增及原位生成PAN

8、I放大SPR信號(hào)構(gòu)建的SPR傳感器相比，檢測(cè)限低3個(gè)數(shù)量級(jí)。該傳感器對(duì)單堿基錯(cuò)配DNA和完全互補(bǔ)DNA有較好的區(qū)分能力。該傳感器具有靈敏度高、選擇性好、通用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在DNA、蛋白質(zhì)和生物小分子的檢測(cè)方面具有良好的應(yīng)用前景。
　　4、通過(guò)靜電作用，將帶正電的PDDA功能化的氧化石墨烯(PDDA-GO)固定在SPR金膜表面，構(gòu)建了簡(jiǎn)單的SPR傳感界面PDDA-GO/Au。該SPR界面可以結(jié)合雙鏈DNA(dsDNA)，使界面的負(fù)電性

9、增加，導(dǎo)致右旋糖苷修飾的金納米粒子(Dex-Au NPs)無(wú)法結(jié)合在SPR界面上。另一方面，銅離子催化的芬頓反應(yīng)能剪切dsDNA，使界面的負(fù)電荷降低，這樣Dex-Au NPs就能結(jié)合在SPR界面上，引起SPR角度的巨大變化。焦磷酸根(PPi)可以和銅離子發(fā)生絡(luò)合，抑制dsDNA的剪切。堿性磷酸酶(ALP)能使PPi發(fā)生水解，使被抑制的DNA剪切得到恢復(fù)，從而使傳感界面的負(fù)電性降低，Dex-Au NPs重新結(jié)合到SPR界面，再次產(chǎn)生明顯的