生物活性小分子電化學(xué)傳感界面的構(gòu)建及其細胞釋放的實時檢測.pdf

1、細胞是生物體形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動的基本單元，其中存在一些具有特殊生理功能的活性小分子物質(zhì)，如活性氮分子(RNS)和活性氧分子(ROS)等。它們是一類含氮或含氧自由基或分子，對于脂類、蛋白質(zhì)以及核酸分子均有較高反應(yīng)活性?；诩毎麅?nèi)RNS和ROS的濃度，它們既可以充當(dāng)“朋友”亦可以是“敵人”，其濃度處于正常值時，參與細胞信號傳導(dǎo)、控制細胞的增殖、分化與凋亡、促進多種因子細胞生物學(xué)效應(yīng)的啟動；而當(dāng)平衡打破，其濃度升高時，則會引起氧化應(yīng)激、導(dǎo)致細

2、胞膜脂質(zhì)過氧化、引起DNA的氧化損傷、介導(dǎo)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變性等，進一步造成細胞癌變和死亡、腫瘤發(fā)生和發(fā)展、甚至心血管疾病等。鑒于此，原位實時定量檢測活細胞釋放RNS和ROS，不僅能幫助我們從分子水平理解它們介導(dǎo)生理過程，而且有助于我們揭示其引發(fā)相關(guān)疾病的機制，從而進行疾病早期檢測、預(yù)防及選擇適當(dāng)?shù)闹委煼椒āＨ欢?，RNS和ROS的實時靈敏檢測極具挑戰(zhàn)性，其釋放的量很少且半衰期短、活性高、易與生物環(huán)境中其他分子發(fā)生反應(yīng)。因此，構(gòu)建有效、靈敏

3、的檢測平臺及生物相容性良好的細胞生長平臺是RNS和ROS原位檢測的關(guān)鍵。電化學(xué)方法操作簡便、特異性強、響應(yīng)快、靈敏度高且成本低，因而成為細胞釋放活性小分子檢測的常用技術(shù)手段。碳材料如碳納米管、石墨烯等被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)平臺的建設(shè)及細胞相關(guān)實驗的研究。
　　本論文設(shè)計并合成了功能納米材料協(xié)同催化的仿生酶，提高了檢測穩(wěn)定性和選擇性，并構(gòu)筑了具有生物兼容性和特異催化活性的納米界面，實現(xiàn)了高靈敏度活細胞釋放RNS和ROS小分子的實時動態(tài)檢

4、測，并深入探討了其催化機理。在此基礎(chǔ)上，進一步構(gòu)建了活細胞直接生長的2D及3D自支撐傳感膜，并系統(tǒng)研究了該傳感膜的細胞粘附及電化學(xué)性能，結(jié)果表明將細胞直接生長在傳感膜上可以大大提高檢測的靈敏度。主要內(nèi)容及結(jié)果歸納如下：
　　1. NO是眾多癌細胞病變過程中釋放的一種信號傳導(dǎo)分子。然而，由于NO極易擴散、濃度低、壽命短，實現(xiàn) NO的實時檢測仍是極大的挑戰(zhàn)。本工作通過水熱法合成了形貌可控的還原氧化石墨烯-二氧化鈰納米復(fù)合物(rGO-C

5、eO2)，并用它來構(gòu)建高靈敏的NO實時檢測傳感器。rGO-CeO2納米復(fù)合物中 CeO2的晶體形貌對rGO-CeO2傳感器的性能有重要影響。其中，六邊形的CeO2納米晶體催化性能最佳，達到了最高的靈敏度(1676.06 mA/(cm2·mol/L))，較寬的線性范圍(18.0 nmol/L到5.6μmol/L)及低的檢測限(9.6 nmol/L)。這一最優(yōu)性能主要歸功于特殊形貌的CeO2良好的催化性能及rGO優(yōu)良的導(dǎo)電性和高的比表面積。

6、本工作展示了一個通用的方法通過有效調(diào)控復(fù)合物中單組分的優(yōu)勢來合成具有超強協(xié)同作用的傳感平臺，同時也為快速實時檢測活細胞釋放NO提供了極大的可能性。
　　2. O2-是細胞釋放的一種ROS小分子，正常情況下對細胞的多種生命活動起著重要的介導(dǎo)作用，但是當(dāng)其含量超過正常水平時，會打破體內(nèi)氧化還原平衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，進而損壞細胞、引發(fā)病變，因此，實時定量檢測細胞釋放的O2-對于疾病的診斷及預(yù)防非常重要。本工作中，采用DNA誘導(dǎo)合成的磷酸錳

7、梭狀材料(DNA@Mn3(PO4)2)作為O2-生物模擬酶功能化修飾氧化石墨烯(GO)。該材料制備的特異性生物模擬酶傳感器表現(xiàn)出較高的靈敏度(1556.97 mA/(cm2·mol/L))、較寬的檢測范圍(6.5 nmol/L到8.85μmol/L)和極低的檢測限(2.1 nmol/L)。此外， DNA@Mn3(PO4)2/GO傳感器實現(xiàn)了原位實時檢測藥物刺激下人類皮膚癌細胞和正常細胞釋放的O2-，表現(xiàn)出良好的實時定量檢測性能。由實驗結(jié)

8、果可得，癌細胞釋放的O2-量為正常細胞的5倍(平均值)。
　　3.原位實時檢測ROS對于研究各種基礎(chǔ)的細胞生理過程極其重要，但是目前報道的工作大多檢測的是生長在培養(yǎng)基中細胞釋放的ROS，其半衰期短、濃度低、活性高，造成測試的靈敏度和選擇性都受到極大的限制。本工作中，我們提出了一種新的方法將活細胞直接生長在 DNA/Mn3(PO4)2修飾的垂直生長碳納米管(VACNT)陣列上來構(gòu)建柔性支撐雜化膜，其中DNA/Mn3(PO4)作為一種

9、高效的O2-仿生歧化酶，表現(xiàn)出很高的電催化活性；VACNT具有優(yōu)異的導(dǎo)電性和生物相容性，提供了快速電子轉(zhuǎn)移載體和細胞生長平臺，此外細胞直接生長在傳感膜表面大大縮短了檢測底物與活性位點之間的擴散距離，從而實現(xiàn)了高靈敏實時檢測癌細胞在藥物刺激下釋放的O2-。與檢測培養(yǎng)基中細胞釋放O2-相比，檢測靈敏度增加了6倍多，證明活細胞分泌的O2-沒有經(jīng)過擴散過程或經(jīng)過很短的擴散距離，直接被生物膜捕獲并催化。這一設(shè)計縮短了細胞釋放的檢測目標(biāo)物與傳感器之

10、間的距離，避免了在此擴散過程中，大部分目標(biāo)物由于活性高、壽命短而衰減的可能性，大大提高了傳感器的靈敏度。
　　4.眾所周知，細胞在生物體內(nèi)的實時生長環(huán)境是三維(3D)的，為了研究人類的生理活動機理，我們必須在體外培養(yǎng)細胞，要想得到更準(zhǔn)確的研究數(shù)據(jù)，創(chuàng)造體外3D細胞培養(yǎng)環(huán)境極其重要。然而，現(xiàn)在報道的大部分工作均是基于2D平臺。本工作中，我們創(chuàng)造了一個3D細胞貼附/生長環(huán)境，首先通過化學(xué)氣相沉積法制備3D泡沫石墨烯(GF)，然后采用綠

11、色、簡易的基底增強-化學(xué)沉積法在GF上修飾Pt納米顆粒。該Pt@GF復(fù)合物表現(xiàn)出良好的多功能性，其中3D大孔GF表現(xiàn)出了擬人體實時生物環(huán)境，為細胞的生長提供了良好的貼附/生長支架以利于后續(xù)細胞釋放O2-的高靈敏實時檢測，此外，Pt納米顆粒對O2-表現(xiàn)出了超強的電催化活性。熒光顯微鏡和掃描電子顯微鏡的觀察結(jié)果表明，細胞在3D Pt@GF復(fù)合物上的生長狀態(tài)、表達、貼附及代謝活動相較其在2D Pt@石墨烯片(Pt@GS)復(fù)合物上，均表現(xiàn)出更優(yōu)