L-谷氨酰胺生產菌的定向改造.pdf

1、L-谷氨酰胺在生命活動中具有重要作用，已被廣泛應用于食品、醫(yī)藥等諸多領域。隨著市場需求的不斷增大，提高谷氨酰胺的生產效率顯得至關重要，而代謝途徑的優(yōu)化可能對生產效率的提高起到非常重要的作用。
　　本文以L-谷氨酰胺生產菌Corynebacterium glutamicum GM34為出發(fā)菌，以提高谷氨酰胺的產量、減少副產物谷氨酸產量和構建溫敏型谷氨酰胺生產菌為目標，對C.glutamicum GM34進行了一系列分子改造。主要研究

2、內容和結果如下:
　　(1)NCgl1221基因編碼的蛋白是重要的谷氨酸分泌載體，為了研究NCgl1221基因缺失對副產物谷氨酸積累的影響，采用同源重組技術敲除了谷氨酰胺生產菌GM34的NCgl1221基因，構建了菌株GM34△NCgl1221。在5L發(fā)酵罐上進行了分批補料發(fā)酵實驗，結果菌株GM34△NCgl1221的谷氨酸積累量為0.17(g/g DCW)，比出發(fā)菌降低了19.1％，而谷氨酰胺的積累量未見明顯變化。
　　(

3、2)丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，Pc，由pyc基因編碼)在谷氨酸棒桿菌的回補途徑中有重要作用。利用穿梭質粒pXMJ19構建了pyc基因過表達菌株GM34pXMJ19pyc。5L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵實驗結果表明，過表達pyc基因使菌體生長速度得到了提升，谷氨酰胺產量為3.3(g/gDCW)，比對照組提高了5.5％。
　　(3)溫度敏感突變株相比現(xiàn)有的生物素缺陷菌株具有非常多的優(yōu)點。ltsA基因的突變可以使某

4、些谷氨酸棒桿菌菌株轉變?yōu)闇囟让舾芯辍＠谜陷d體pK18mobsacB，通過同源重組技術敲除了谷氨酰胺生產菌GM34的ltsA基因，構建了菌株GM34△ltsA。培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)GM34△ltsA38℃下仍能生長。在5L發(fā)酵罐上進行發(fā)酵實驗，發(fā)現(xiàn)溫度轉換不能誘導L-谷氨酰胺分泌。說明ltsA基因缺失不能使GM34轉變?yōu)闇囟让舾型蛔冎?，這為以后的進一步改造提供了一定的借鑒。
　　(4)PH控制對谷氨酰胺發(fā)酵有重要影響。發(fā)酵20h左右，發(fā)酵