L-谷氨酰胺高產(chǎn)菌株的選育及其發(fā)酵過程的優(yōu)化.pdf

1、L-谷氨酰胺(L-Glutamine，簡稱Gin)是由L-谷氨酸的γ-羧基酰胺化的一種條件必須氨基酸，它是一種重要的營養(yǎng)物質(zhì)，也是一種極有發(fā)展前途的新藥，在臨床上主要用于治療腦神經(jīng)疾病及消化道潰瘍。世界上生產(chǎn)谷氨酰胺的主要生產(chǎn)國是日本，韓國也有少量生產(chǎn)，均采用發(fā)酵法。1997年日本開始發(fā)酵生法生產(chǎn)，到20世紀(jì)90年代中期其發(fā)酵水平達(dá)到60g/L，韓國的發(fā)酵水平為50g/L。目前，我國的藥用谷氨酰胺尚屬空白，采用發(fā)酵生產(chǎn)的廠家也幾乎沒有。

2、生產(chǎn)谷氨酰胺的前提是要有谷氨酰胺高產(chǎn)菌株。為此，我們進(jìn)行了高產(chǎn)菌株的定向選育研究及其發(fā)酵條件的優(yōu)化研究。 谷氨酰胺的生物合成是以谷氨酸為前體物質(zhì)，在谷胺酰胺合成酶的催化下酰胺化生成。所以，谷氨酰胺高產(chǎn)的前提是谷氨酸高產(chǎn)。我們首先以一株谷氨酸高產(chǎn)的谷氨酸棒狀桿菌(CorynebacteriumglutamicumA-26)為出發(fā)菌株，先后采用亞硝基胍(NTG)，紫外線等進(jìn)行誘變，并選用谷氨酰胺的兩種結(jié)構(gòu)類似物磺胺胍(SG)、甲硫氨

3、酸亞砜(MSO)以及硫酸銨((NH4)2SO4)篩選出具有三重抗性標(biāo)記的谷氨酰胺高產(chǎn)菌株C.glutamicumN-U-6，其谷氨酰胺最高產(chǎn)量可達(dá)33.54g/L，比出發(fā)菌株的產(chǎn)量(15.64g/L)高出1.14倍。并檢驗(yàn)了其具有較好的遺傳穩(wěn)定性。 然后對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。首先采用單次單因子非統(tǒng)計(jì)優(yōu)化技術(shù)確定了它在250mL的搖瓶培養(yǎng)條件為：最佳碳源為150g/L葡萄糖，最佳無機(jī)氮源及其濃度為：40g/LNH4Cl；最佳

4、有機(jī)氮源及其濃度：14g/L尿素；玉米漿濃度：1g/L，初始pH為7.2，培養(yǎng)溫度為30℃，接種量為10％，種齡為12h，裝液量為30ml。谷氨酰胺產(chǎn)量達(dá)到37.21g/L，比優(yōu)化前的突變株提高10.9％。 之后，利用Placktt-Burman法從葡萄糖、尿素、NH4Cl、MnSO4、FeSO4和ZnSO4的濃度七個(gè)因子中篩選出尿素、NH4Cl和ZnSO4的濃度三個(gè)對(duì)產(chǎn)胺的影響較大的重要因子。接著采用響應(yīng)面法確定了它們的最佳值

5、，并結(jié)合初步優(yōu)化結(jié)果，得到了一個(gè)比較適合突變菌株C.glutamicumN-U-6進(jìn)行谷氨酰胺合成的發(fā)酵培養(yǎng)條件為(g/L)：葡萄糖150，玉米漿10，尿素12.7，NH4Cl23.6，KH2PO40.5，K2HPO40.5，MgSO405，F(xiàn)eSO40.02，MnSO40.025，ZnSO40.004，初始pH7.2。CglutamicumN-U-6在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下最高產(chǎn)量達(dá)39.53g/L，比優(yōu)化前的33.54g/L提高17.8

6、6％。 最后對(duì)C.glutamicumN-U-6進(jìn)行了5-L發(fā)酵罐的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。在采用攪拌速率為850rpm和通氣量為1.5VVM的條件下，在發(fā)酵中后期流加30％的尿素達(dá)到控制pH維持6.2，同時(shí)達(dá)到補(bǔ)充氮源的雙重目的，進(jìn)一步提高了產(chǎn)量，最高達(dá)56.67g/L，發(fā)酵周期縮短到44小時(shí)。我們還進(jìn)行了氮饑餓處理的實(shí)驗(yàn)：初期脲量減少為原來的60％，后期補(bǔ)加尿素以補(bǔ)充氮源同時(shí)也起到控制pH的作用，谷氨酰胺的產(chǎn)量達(dá)到62.52g/L，比氮饑