基于納米材料構(gòu)建新型蛋白激酶?jìng)鞲衅?pdf

1、在人類基因組計(jì)劃中發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)有超過(guò)2000種的激酶，其中編碼蛋白激酶基因的數(shù)量超過(guò)500種。蛋白激酶催化磷酸化在調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起重要作用，其涉及大多數(shù)重要的胞內(nèi)過(guò)程如細(xì)胞生長(zhǎng)、新陳代謝、分化、增殖和凋亡。通常情況下，蛋白激酶活性的異常和過(guò)表達(dá)會(huì)引起細(xì)胞信號(hào)的反常，這些反常的信號(hào)又與一系列常見(jiàn)疾病包括癌癥、糖尿病、炎癥、心臟疾病和老年癡呆癥有關(guān)聯(lián)。因此，檢測(cè)蛋白激酶活性不僅對(duì)理解這些疾病相關(guān)的基礎(chǔ)生化過(guò)程很有價(jià)值，而且對(duì)臨床診斷和藥物

2、研發(fā)有重要作用。
　　 目前檢測(cè)蛋白激酶的方法主要基于放射性γ-32/33p-ATP、熒光、電化學(xué)、表面等離子共振和質(zhì)譜等技術(shù)。這些方法雖能有效檢測(cè)蛋白激酶，但都在某些方面存在各自的不足，如放射性方法由于有害放射性元素的使用而對(duì)人類健康和環(huán)境有很大威脅，在一些方法中涉及標(biāo)記、孵育、封閉、清洗、檢測(cè)信號(hào)的生成和放大等多步檢測(cè)過(guò)程，其是非常費(fèi)時(shí)耗力的。因此構(gòu)建靈活快速、通用和低耗高效的激酶分析方法仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。
　　 基于上

3、述陳述，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，本論文利用各種新型納米材料（金納米粒子、石墨烯）的獨(dú)特內(nèi)在性質(zhì)和肽鏈端解酶的水解性質(zhì)，構(gòu)建了三種新穎且快速檢測(cè)蛋白激酶的分析傳感平臺(tái)。具體如下:
　　 1、我們?cè)O(shè)計(jì)了一種新穎的基于磷酸化阻礙羧肽酶(CPY)水解的比色金納米粒子(AuNPs)/多肽平臺(tái)用于檢測(cè)蛋白激酶活性和抑制作用。該AuNPs/多肽平臺(tái)通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光計(jì)甚至肉眼觀察溶液顏色變化來(lái)檢測(cè)激酶活性。其能靈敏檢測(cè)cAMP依賴型蛋白激酶(PKA)的

4、活性進(jìn)而證明該方法的可行性，對(duì)PKA檢測(cè)有較低的檢測(cè)限(0.232 mU/μL)，通過(guò)H-89來(lái)評(píng)估激酶抑制作用，其IC50值為18.13 nM。該分析方法還能成功地用于細(xì)胞裂解液中激酶活性的檢測(cè)。由于其無(wú)標(biāo)記、均相、同源和比色檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，該方法在高通量篩選激酶相關(guān)的目標(biāo)藥物上有巨大的潛能。
　　 2、我們構(gòu)建了一種新穎且快速的熒光傳感平臺(tái)用于監(jiān)測(cè)蛋白激酶，其基于氧化石墨烯(GO)的超淬滅能力和適配體多肽(FITC-IP20)的

5、特異識(shí)別。在該GO/多肽平臺(tái)中，F(xiàn)ITC-IP20吸附到GO表面而引起熒光淬滅，由于適配體多肽和活性蛋白激酶(PKA)的特異結(jié)合而導(dǎo)致其熒光恢復(fù)。其是一個(gè)“turn-on”的快速激酶檢測(cè)方法（大約10 min）。該方法能靈敏檢測(cè)PKA活性，檢測(cè)限為0.053 mU/μL。這一分析方法同樣適用于細(xì)胞裂解液中激酶活性檢測(cè)。此外，該基于GO的分析方法可作為一個(gè)通用平臺(tái)用于檢測(cè)不同的蛋白激酶，只需改變其特定的同源適配體多肽。因此，該構(gòu)建的方法不

6、僅為蛋白激酶生物傳感提供一項(xiàng)有潛力的技術(shù)，而且作為一個(gè)令人感興趣的例子拓展了GO在翻譯后修飾酶研究中的應(yīng)用。
　　 3、我們構(gòu)建了一種基于氧化石墨烯(GO)/多肽納米復(fù)合物和磷酸化阻礙羧肽酶(CPY)水解的生物傳感平臺(tái)檢測(cè)蛋白激酶活性。激酶催化的磷酸化能抑制CPY消化熒光團(tuán)標(biāo)記的多肽探針，形成GO/多肽復(fù)合物，進(jìn)而導(dǎo)致熒光淬滅。然而未磷酸化多肽能被CPY降解從而釋放熒光團(tuán)，熒光恢復(fù)。該基于GO的納米傳感器成功地用于激酶模型PKA