生物納米材料構(gòu)建蛋白激酶活性傳感與蛋白質(zhì)直接電化學(xué).pdf

1、蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究是生命科學(xué)研究中的熱點。激酶催化下的磷酸化修飾涉及細胞信號傳導(dǎo)、肌肉收縮、神經(jīng)活動以及細胞的增值、發(fā)育和分化等生理病理過程。磷酸化的異常以及激酶的過度表達往往與許多重大疾病有關(guān)，如癌癥、糖尿病和老年癡呆癥。目前對蛋白激酶活性的傳感研究不多，方法局限，因此開發(fā)檢測蛋白激酶新方法和篩選抑制劑用于臨床治療亟不可待。
　　 另一方面，研究氧化還原蛋白質(zhì)在電極界面的直接電子傳遞對理解他們在

2、生物體內(nèi)電子轉(zhuǎn)移機制和生理作用具有重要意義。然而蛋白質(zhì)的活性中心深埋在內(nèi)部，很難實現(xiàn)蛋白質(zhì)的直接電化學(xué)。為了實現(xiàn)蛋白質(zhì)可逆的電化學(xué)行為，探索電子傳遞的促進劑是大家關(guān)注的焦點。
　　 基于以上考慮，綜合文獻報道，本論文利用不同納米材料(納米金、量子點、石墨烯等)的獨特性質(zhì)，開發(fā)出多種無標(biāo)記快速蛋白激酶活性檢測方法。另外，將玻碳、碳納米管進行電化學(xué)陰極處理，實現(xiàn)了氧化還原酶的直接電化學(xué)。具體細節(jié)如下：
　　 (1)構(gòu)建了一種

3、基于未修飾CdTe量子點聚集行為的無標(biāo)記熒光分析方法用來檢測蛋白激酶活性及其抑制作用。帶正電的底物多肽引起表面帶負(fù)電荷的CdTe量子點有選擇性的聚集。激酶催化底物多肽磷酸化，由于磷酸基團的引入，改變了多肽的電荷，阻礙了量子點的聚集，引起熒光信號加強、發(fā)射波長有45nm藍移，且熒光發(fā)生由黃到綠的顏色變化。因此，熒光強度及其顏色的響應(yīng)，使得這種基于量子點聚集的熒光分析法可以通過光譜儀甚至肉眼較容易地檢測到蛋白激酶活性。對蛋白激酶PKA的檢測

4、有較低的檢測限(0.47 mUμL-1)，其高靈敏檢測證實了該方法在開發(fā)蛋白激酶活性分析方法上的可行性?；诹孔狱c的熒光響應(yīng)，估算得出的PKA的抑制劑H-89的IC50值為138 nM，與文獻值相當(dāng)。此外，該方法可以用來檢測在Forskolin/IBMX激活的細胞裂解液中的PKA。本方法相對于以往的激酶活性檢測方法相比，不需要多肽標(biāo)記和量子點修飾，為實現(xiàn)高效低耗檢測激酶活性和抑制劑的篩選提供可能。
　　 (2)設(shè)計了一種用于檢測

5、蛋白激酶活性及抑制劑的Label-free型電化學(xué)方法，即利用Zr4+與磷酸基的穩(wěn)定交聯(lián)，將DNA修飾的金納米粒子(DNA-AuNPs)與磷酸化多肽交聯(lián)。由于DNA-AuNPs帶大量負(fù)電荷，電活性物質(zhì)[Ru(NH3)6]3+分子便能定量地吸附在磷酸化位點上，因此可以通過[Ru(NH3)6]3+的信號采用電化學(xué)計時電量法檢測蛋白激酶的活性。抑制劑H-89對于PKA的IC50值估算為33 nM，與文獻報道相近。
　　 (3)介紹了一

6、種基于壓電石英晶體微天平(QCM)實時監(jiān)測適配體多肽與蛋白激酶相互作用的、新穎的、一步法快速檢測蛋白激酶的方法。以PKA為例，將IP20作為適配體多肽通過組氨酸標(biāo)簽(His6-tag)與金屬離子的螯合作用，相同取向地固定在壓電石英晶體金電極表面，這一多肽組裝方法避免了蛋白的非特異性吸附。QCM對蛋白激酶結(jié)合上IP20表面的靈敏頻率響應(yīng)，使得我們能實時監(jiān)測蛋白激酶，并且能定量分析蛋白激酶PKA的濃度。與之前報道方法不一樣的是，適配體多肽與

7、蛋白激酶之間的識別不涉及激酶催化的磷酸化過程，因此監(jiān)測快速無需標(biāo)記，也不需要設(shè)計信號輸出機制獲得最終實驗結(jié)果，可以實現(xiàn)蛋白激酶的一步法檢測(時間不超過10 min)。這一新方法同樣可用于在細胞裂解液中分析PKA催化亞基的含量。
　　 (4)首次提出了一種基于石墨烯/多肽復(fù)合物和羧肽酶降解作用的激酶活性分析方法。FITC標(biāo)記的CKII底物多肽FITC-peptide(FITC-RRRADDSDDDDD)，能與GO發(fā)生有效的熒光淬滅

8、。羧肽酶CPY能作用于任何一個C-末端殘基，從肽鏈的C端開始逐個降解，釋放出游離氨基酸。FITC-peptide在CPY的消化作用下釋放出游離的FITC分子，在高離子強度環(huán)境下，游離FITC分子與GO之間的吸附較小而保持相當(dāng)強的熒光。而當(dāng)FITC-peptide在CKII/ATP催化發(fā)生磷酸化，有效地阻礙CPY在磷酸化絲氨酸位點的降解，使得FITC-多肽更容易與GO結(jié)合而導(dǎo)致熒光淬滅。因此根據(jù)熒光強度的變化可以檢測蛋白激酶的活性。這種由

9、蛋白激酶催化磷酸化誘導(dǎo)的多肽/GO復(fù)合物熒光強度的變化，有望為高通量檢測蛋白激酶活性及其篩選抑制劑提供新的思路。
　　 (5)在含0.05 M四丁基溴化銨(TBAB)的二甲亞砜(DMF)溶液中，用電化學(xué)循環(huán)伏安法可以得到表面納米化玻碳(SNGC)電極，玻碳電極表面的含碳微粒的粒徑分布在10-40 nm之間。相對于普通的玻碳電極，表面納米化玻碳電極對葡萄糖氧化酶GOD的直接電化學(xué)有更高的催化活性，原因在于SNGC電極表面呈現(xiàn)出高比

10、例的邊緣原子。在SNGC表面，GOD的循環(huán)伏安曲線呈現(xiàn)一對完好的、準(zhǔn)可逆的氧化還原峰。
　　 (6)本文提出了一種改良碳納米管(CNT)電催化性能的簡單便利方法，并將其用于生化酶的直接電化學(xué)。在含0.05 M TBAB的DMF中，將CNT修飾電極從0--2.8 V電化學(xué)循環(huán)伏安掃描10個片段，得到陰極修飾碳納米管(CM-CNTs)。透射電子顯微鏡(TEM)下觀察到刻蝕后的CNT呈現(xiàn)較多的缺陷，因此裸露出更多的碳邊緣原子，有效地改