Bacillus subtilis堿性果膠酶的生產(chǎn)及基因工程菌株的構(gòu)建.pdf

1、堿性果膠酶一般指果膠裂解酶中的聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)。來(lái)源于Bacillus subtilis堿性聚半乳糖醛酸裂解酶已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于紡織工業(yè)，韌皮纖維脫膠，污水預(yù)處理等。本論文在實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)上，采用補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝，通過(guò)對(duì)補(bǔ)料培養(yǎng)基中碳源底物的酶法預(yù)處理和pH優(yōu)化控制策略，提高菌株B.subtilis7-3-3的PGL產(chǎn)量。與對(duì)照相比，優(yōu)化后發(fā)酵38 h，PGL酶活力從202.5U mL-1(48 h)增加到743.5 U

2、mL-1，平均PGL生產(chǎn)速率達(dá)到19.6 U(mL h)-1。研究發(fā)現(xiàn)B.subtilis7-3-3的PGL的合成分泌與細(xì)胞生長(zhǎng)呈現(xiàn)相關(guān)性，較高的細(xì)胞濃度對(duì)應(yīng)較高的PGL產(chǎn)量;同時(shí)B.subtilis7-3-3生產(chǎn)PGL不受純果膠的誘導(dǎo)。
　　 從B.subtilis7-3-3粗酶液中分離純化出了PelA蛋白，研究了PelA的性質(zhì)，其分子量約為45 kDa，最適溫度和pH分別為55℃和9.4。進(jìn)一步通過(guò)構(gòu)建穿梭表達(dá)質(zhì)粒pNW33

3、N-pelA，實(shí)現(xiàn)了pelA基因在B.subtilis7-3-3中的同源過(guò)表達(dá)，目的是通過(guò)提高pelA基因的拷貝數(shù)來(lái)提高PGL產(chǎn)量。在7.5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵44 h，同源過(guò)表達(dá)菌株B-pN-pelA的PGL酶活力增加到2138 UmL-1，生產(chǎn)速率達(dá)到了48.58 U(mL h)-1。超過(guò)目前已報(bào)道的PGL的最高產(chǎn)量。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)B-pN-pelA PGL粗酶液的纖維素酶酶活力低，在50℃下4h能夠脫除苧麻纖維50.58％的膠質(zhì)。同時(shí)

4、，工程菌B.subtilis B-pN-pelA具有良好的遺傳穩(wěn)定性，在脫膠工業(yè)中具有較好的應(yīng)用前景。
　　 由于pelA基因啟動(dòng)子具有高效的啟動(dòng)能力，推測(cè)其可以在B.subtilis7-3-3中啟動(dòng)更多其它基因的轉(zhuǎn)錄。將pelA基因啟動(dòng)子(PpelA)和終止子(Tpel4)連接到pNW33N質(zhì)粒，構(gòu)建得到B.subtilis-E.coli穿梭表達(dá)質(zhì)粒pNW33N-PAT。對(duì)pelB，pelC基因進(jìn)行了克隆和測(cè)序，并對(duì)其進(jìn)行了系

5、統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析和同源模建，發(fā)現(xiàn)其與B.subtilis來(lái)源的聚半乳糖醛酸裂解酶蛋白具有高度相似性。以pNW33N-PAT構(gòu)建pelB，pelC重組質(zhì)粒，SDS-PAGE和Western blotting驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，該質(zhì)粒成功實(shí)現(xiàn)了pelB和pelC在B.subtilis7-3-3中的同源過(guò)表達(dá)。
　　 由于對(duì)B.subtilis7-3-3同源過(guò)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化時(shí)出現(xiàn)了與一個(gè)鎳柱結(jié)合的雜蛋白，無(wú)法獲得純的PelB和PelC蛋白。為了研

6、究PelB和PelC的性質(zhì)，本論文以P.pastoris GS115為宿主，對(duì)pelA，pelB和pelC進(jìn)行了異源表達(dá)，驗(yàn)證了糖基化對(duì)PelA，PelB和PelC分子量大小和PGL酶活力的影響，結(jié)果表明糖基化對(duì)這個(gè)三個(gè)蛋白的酶活力影響不顯著。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，PelB的最適溫度為60℃，最適pH為9.0，在40℃或pH7.0-10.6下具有較高的穩(wěn)定性;PelC最適溫度為50℃，最適pH為9.5，在30℃和pH8.0下具有較好穩(wěn)定性。