低醇啤酒基因工程菌株的構(gòu)建及其發(fā)酵參數(shù)的分析.pdf

1、低醇啤酒既具有啤酒應(yīng)有的啤酒風(fēng)味，又具有多飲不醉的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也符合當(dāng)今消費(fèi)者日益重視身體健康的消費(fèi)趨勢(shì)，加上婦女對(duì)酒精過敏男士對(duì)低醇啤酒的喜愛，低醇啤酒正在走俏。 啤酒乙醇的含量是決定低醇啤酒的關(guān)鍵指標(biāo)，它直接關(guān)系到啤酒的品質(zhì)。如何解決啤酒中乙醇的含量是生產(chǎn)低醇啤酒的關(guān)鍵。目前，降低啤酒中乙醇含量的辦法有很多種，其中最理想的方法之一就是構(gòu)建低醇啤酒基因工程菌株，通過對(duì)工業(yè)用釀酒酵母本身進(jìn)行改造來(lái)生產(chǎn)低醇啤酒。 在釀酒酵母

2、代謝過程中，控制乙醇產(chǎn)量的關(guān)鍵酶就是乙醇脫氫酶Ⅰ(ADH Ⅰ)，它催化代謝中的乙醛生成乙醇。乙醇脫氫酶Ⅰ(ADH Ⅰ)的活力大小直接關(guān)系著釀酒酵母乙醇的產(chǎn)量。通過對(duì)工業(yè)用釀酒酵母的改造，利用基因敲除的方法去除其自身的ADHⅠ，然后轉(zhuǎn)入相對(duì)酶活力較弱的ADH Ⅰ基因就能夠達(dá)到降低乙醇含量的目的。 本研究采用LFH-PCR法從質(zhì)粒pCAMBIA中擴(kuò)增出兩端帶有與釀酒酵母ADH Ⅰ同源序列的潮霉素基因片段，利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的潮霉

3、素基因片段導(dǎo)入工業(yè)釀酒酵母(HDY-01)中去，外源基因片段通過同源部分與釀酒酵母染色體重組并整合到染色體上，破壞了釀酒酵母的ADH Ⅰ基因，從而構(gòu)建了△ADHⅠ釀酒酵母。然后，根據(jù)GeneBank上登錄的枯草芽孢桿菌的ADH Ⅰ(BADH Ⅰ)基因序列(CNC000964)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物(引物上下游帶有XBa Ⅰ的酶切位點(diǎn))，對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的片斷與pYC6/CT載體連接，構(gòu)建表達(dá)載體DYC6/CT-BADH Ⅰ，利用醋

4、酸鋰轉(zhuǎn)化法將表達(dá)載體pYC6/CT-BANf Ⅰ轉(zhuǎn)入AADH Ⅰ釀酒酵母，構(gòu)建低醇啤酒基因工程菌株。 通過低溫發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，比較了HDY-01酵母，△ADH Ⅰ酵母，和BADH Ⅰ-△ADH Ⅰ酵母三株菌株的生長(zhǎng)狀況及發(fā)酵液中的乙醛、乙醇、雙乙酰、殘?zhí)?、懸浮酵母?shù)、二甲基硫、甲酸乙酯、乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇、乙酸異戊、異戊醇等的含量。 發(fā)現(xiàn)BADHⅠ～△ADHⅠ酵母的生長(zhǎng)狀況比HDY-01酵母和△ADH Ⅰ酵母穩(wěn)定，在整個(gè)