尿酸酶基因工程菌的構(gòu)建與分泌表達(dá).pdf

1、尿酸是嘌呤分解代謝產(chǎn)物，部分動(dòng)物將尿酸通過尿酸酶（Uricase,EC1.7.3.3）的作用轉(zhuǎn)化為水溶性更好的尿囊素排出體外，由于人類在進(jìn)化過程中尿酸酶基因發(fā)生突變，因此，只能以尿酸的形式排出。尿酸排出體外有兩種途徑，一為通過腎臟排泄（約占排泄量的2/3），但是由于尿酸本身的水溶性有限，增加腎臟尿酸排泄通常易引起腎臟尿酸結(jié)石，更加重了對(duì)腎功能的損害；一是通過腸道排泄，腸道在排出尿酸中的作用正常情況下雖居于次要地位（約占排泄量的1/3），

2、但是可降低通過腎臟排泄的副作用，主要通過采用蒙脫石吸附、活性炭吸附、腸道透析、進(jìn)食含高膳食纖維的食物等措施降低腸道尿酸水平，它們或具有降低腸腔尿酸濃度或具有阻止尿酸從腸道吸收入血，增加尿酸從糞便的排出進(jìn)而具有降血尿酸的效果，但是這幾個(gè)方法有局限性，不適合長(zhǎng)期治療應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建尿酸酶基因工程菌，使尿酸酶持續(xù)表達(dá)并分泌到胞外，促使腸道尿酸轉(zhuǎn)化為尿囊素，不僅可阻止腸道尿酸吸收入血，也可加速血尿酸向腸道的擴(kuò)散，進(jìn)而達(dá)到降低血尿酸的作用，為探

3、索高尿酸血癥新的治療手段提供依據(jù)。
　　1.構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET-28a-sUOX
　　以產(chǎn)朊假絲酵母菌（中國普通微生物菌種保藏管理中心，CGMCC2.120）基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增尿酸酶編碼基因，同時(shí)，以金黃色葡萄球菌（ATCC6538）基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增金黃色葡萄球菌蛋白A（Staphylococcal protein a，SPA）信號(hào)肽編碼基因。重新改造原核表達(dá)載體pET-28a，利用PCR技

4、術(shù)刪除LacO和LacI序列，便于不需誘導(dǎo)劑的作用表達(dá)尿酸酶，同時(shí)便于轉(zhuǎn)化至DH5α中。將尿酸酶編碼基因和SPA信號(hào)肽編碼基因通過DNA連接實(shí)驗(yàn)連接后克隆至pET-28a載體中，命名為pET-28a-sUOX,進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank查詢結(jié)果一致。
　　2.尿酸酶的表達(dá)
　　將測(cè)序正確的重組表達(dá)載體pET-28a-sUOX轉(zhuǎn)化到DH5α中，不需誘導(dǎo)劑的作用進(jìn)行目的蛋白表達(dá)。分別收集6h、9h、12h、15h、18h