基于聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯的陽離子納米載體及其對siRNA的體內(nèi)外遞送功效.pdf

1、小RNA干擾(siRNA)技術(shù)是提高抗腫瘤效果的新途徑，但siRNA體內(nèi)效果的發(fā)揮依賴于載體的有效遞送。聚陽離子是一類倍受關(guān)注的具有優(yōu)良性能的siRNA非病毒載體，但納米遞送系統(tǒng)需要協(xié)調(diào)發(fā)揮siRNA負(fù)載、輸運(yùn)和釋放功能，而這些功能的協(xié)調(diào)發(fā)揮取決于遞送系統(tǒng)的多功能組裝和結(jié)構(gòu)控制。為了探討聚陽離子載體的理想結(jié)構(gòu)并揭示其作用機(jī)理，在前期研究基礎(chǔ)上，本文以聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(PDMAEMA)為聚陽離子段，以聚己內(nèi)酯(PCL)為疏水段，P

2、EG為親水段，研究了嵌段、接枝結(jié)構(gòu)的兩親性聚合物結(jié)構(gòu)與其功能性的關(guān)系；還探討了PDMAEMA修飾的介孔硅以及溫敏非離子型納米載體體系的siRNA遞送功效。
　　首先，本文合成了聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(mPEG-PCL-b-PDMAEMA, PECbD)嵌段共聚物以及聚乙二醇-嵌段-(聚己內(nèi)酯-接枝-聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯)(mPEG-PCL-g-PDMAEMA, PECgD)梳型聚合物，并通過自組裝制備了兩

3、種聚合物納米粒(NPs)載體，用于研究體外和體內(nèi)遞送siRNA的功效。表征了PECbD NPs/siRNA和PECgD NPs/siRNA復(fù)合物的理化參數(shù)，如粒徑、zeta電勢等。在HeLa-Luc細(xì)胞上評價了其體外毒性、細(xì)胞內(nèi)吞以及基因沉默效率。通過共聚焦顯微鏡觀察了兩種復(fù)合物的內(nèi)涵體逃逸以及細(xì)胞內(nèi)分布情況。分別用小鼠和荷瘤小鼠研究了載體介導(dǎo)的siRNA體內(nèi)分布情況。在相同的DMAEMA聚合度和N/P下，PECgD NPs/siRNA

4、復(fù)合物比PECbD NPs/siRNA復(fù)合物表現(xiàn)出更高的zeta電勢，導(dǎo)致更多的siRNA被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而產(chǎn)生了更好的熒光素酶及l(fā)amin A/C沉默效率。組織成像以及冰凍切片觀察結(jié)果表明, PECgD納米粒比PECbD納米粒能夠更好的遞送siRNA到達(dá)肺、肝、胰腺和皮下接種的HeLa腫瘤組織中。同時，PECgD納米粒表面較短的PDMAEMA鏈更利于從機(jī)體內(nèi)排出，降低毒副作用。
　　為了進(jìn)一步發(fā)展聚乙二醇-嵌段-(聚己內(nèi)酯-

5、接枝-聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯)作為siRNA載體的能力，在此基礎(chǔ)上，本文通過在聚乙二醇化的聚己內(nèi)酯(PCL)和接枝的聚甲基丙烯酸二甲氨基(PDMAEMA)之間，引入對細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)還原環(huán)境敏感的二硫鍵，制備出一種膠束型的可響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境脫殼的納米粒。由PECssD自組裝成的納米粒含有生物可降解的PCL內(nèi)核、PEG保護(hù)層和可斷裂的聚陽離子殼層。該納米粒能夠與siRNA形成穩(wěn)定的膠束復(fù)合物PECssD/siRNA，可以延長siRNA在體內(nèi)的

6、存留時間，提升其在腫瘤部位的聚集，并且更利于內(nèi)吞。特別地，二硫鍵在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高濃度的谷胱甘肽等還原物質(zhì)存在下，在細(xì)胞內(nèi)斷裂，導(dǎo)致PDMAEMA/siRNA多聚物從聚乙二醇化的聚己內(nèi)酯內(nèi)核上脫落，進(jìn)而促進(jìn)了內(nèi)涵體逃逸以及siRNA的有效釋放。因此，siRNA在細(xì)胞質(zhì)中的含量大大增加，并且提高了siRNA的基因沉默效率。此外，在接種HeLa-Luc腫瘤的裸鼠模型上，通過系統(tǒng)給藥的方式注射攜帶siPlk1(特異性靶向Polo樣激酶1的siRN

7、A)的該納米粒，產(chǎn)生了良好的腫瘤抑制效果，證明該陽離子可斷裂的PECssD納米?？蓾M足體內(nèi)多級siRNA遞送過程的需要。另外，本文還證明了PECssD/siRNA復(fù)合膠束的疏水內(nèi)核能夠包載疏水性抗癌藥物紫杉醇，未來可以進(jìn)一步用于siRNA和藥物的協(xié)同給藥治療。
　　盡管上述PDMAEMA基的梳型聚合物納米粒具有較好的siRNA體內(nèi)外遞送效果，但存在一定的毒性。因此，為了降低由陽離子載體帶來的毒副作用，本文還采用了不同的策略設(shè)計制備

8、了兩種新型的siRNA遞送系統(tǒng)。
　　對于siRNA載體而言，易于制備和較低制作成本的低毒高效載體一直是人們追求的目標(biāo)。為達(dá)到這一目的，本文制備了一種聚陽離子-介孔硅雜化納米粒(ssCP-MSNs)。通過在介孔硅內(nèi)外表面吸附甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)，并用含二硫鍵的交聯(lián)劑交聯(lián)DMAEMA，使其原位聚合得到納米粒，對該納米粒進(jìn)行了體外和體內(nèi)評價。所合成的ssCP-MSNs粒徑為100-150 nm，含有10 nm的孔徑，

9、且表面的正電荷為27 mV。該納米粒具有較強(qiáng)的siRNA負(fù)載能力，能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)吞，并增加細(xì)胞質(zhì)中siRNA的含量。此外，由二硫鍵交聯(lián)的PDMAEMA段，在響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境而斷裂后，引發(fā)了PDMAEMA從ssCP-MSNs上的脫離，促進(jìn)了siRNA在細(xì)胞內(nèi)的釋放。因此，在HeLa-Luc細(xì)胞上觀察到了很強(qiáng)的基因沉默效率，與Lipofectamine2000相當(dāng)。特別值得指出的是，與Lipofectamine2000相比，ssCP-MS

10、Ns表現(xiàn)出更強(qiáng)的生物相容性，在HeLa-Luc細(xì)胞上沒有毒性，甚至能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。體內(nèi)分布實(shí)驗證明，在通過靜脈注射后，ssCP-MSNs能夠延長siRNA在體內(nèi)的存留時間，并且聚集在腎上腺、肝、肺、脾、腎、心臟和胸腺中。此外，ssCP-MSNs能夠通過靜脈注射遞送siRNA至腫瘤，并且在接種HeLa-Luc腫瘤的裸鼠模型上取得了顯著的腫瘤抑制效果。但體內(nèi)長循環(huán)效果仍有待提高。
　　眾所周知，陽離子載體的毒性通常是由于較強(qiáng)的正電荷

11、引起的細(xì)胞毒性。因此，本文采用的第二種降低載體毒性的策略就是開發(fā)一種不帶正電荷的遞送系統(tǒng)。本文用聚乙二醇(mPEG)嵌段聚異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)(mPEG-PNIPAM)、3β-(N,N-二甲基氨基乙基)-氨基甲?；鵠膽固醇(DC-Chol)，通過雙乳化溶劑揮發(fā)法成功設(shè)計制備了一種溫敏性釋放siRNA的納米遞送系統(tǒng)。該納米粒的zeta電勢為-3.5±1.3 mv。冷擊會改變該納米粒的形貌和尺寸，進(jìn)而促進(jìn)siRNA從納米粒中的釋放