粗品肝素中有害雜質(zhì)的檢測.pdf

1、肝素是Dag Mclean在1916年研究凝血機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種酸性粘多糖。它是一種是由糖醛酸(L-艾杜糖醛酸 IdoA;D-葡萄糖醛酸GlcA)和葡萄糖胺(α-D葡萄糖胺GlcN)組成的具有不同鏈長的多糖鏈混合物。到目前為止,還沒有能夠完全代替它的藥品,仍是最重要的生化藥物之一。肝素廣泛分布在哺乳動物肝、肺、腸粘膜、心、腎、脾、胎盤、胸腺、肌肉和血液等組織中。2008年,從海外進(jìn)入美國的肝素原料藥和最終成品中發(fā)現(xiàn)人為添加的多硫酸軟骨素(

2、over-sulfated chondroitin sulfate,OSCS)。隨著有關(guān)肝素產(chǎn)品的有害報(bào)導(dǎo)的不斷增加,通過 FDA、企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)的協(xié)作研究證實(shí)某些病人的過敏反應(yīng)與在肝素中存在OSCS有關(guān)。因此,OSCS的檢測成了肝素粗品質(zhì)量控制重要指標(biāo)之一。據(jù)國外文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)核磁共振氫譜(1H-nuclear magnetic resonance,1H-NMR)從OSCS污染的肝素中可以檢測到異于肝素的N-乙酰基甲基峰,通過檢測這一特征峰

3、可以判斷肝素中是否含有OSCS污染物。另外,國外的研究團(tuán)隊(duì)對強(qiáng)陰離子交換高效液相色譜(strong anion exchange-high performance liquid chromatography,SAX-HPLC)檢測肝素中OSCS含量的方法進(jìn)行了相關(guān)的研究。由于牛海綿狀腦病以及其他動物病毒疾病的存在,豬來源的唯一性就成了確保肝素安全性的一條關(guān)鍵要求。本研究的主要工作如下:
　　1.1H-NMR檢測粗品肝素中OSCS<

4、br>　　調(diào)節(jié)pH除去粗品肝素中的蛋白質(zhì),以80％乙醇等體積沉淀肝素對粗品肝素進(jìn)行了預(yù)處理;以400MHz、298K和64次掃描的條件檢測粗品肝素的N-乙?；谆盘?。經(jīng)過多次試驗(yàn)均未檢測到待測樣品中存在的OSCS的N-乙?；谆逍盘?而DS(硫酸皮膚素)的N-乙酰基甲基峰信號總是伴隨著肝素的信號出現(xiàn)。因此判定待檢粗品肝素樣品未受人為添加的OSCS的污染,并且含有大量的DS。通過添加適當(dāng)?shù)腛SCS標(biāo)準(zhǔn)品至粗品肝素中,考察1H-NMR檢

5、測OSCS的檢測限。當(dāng)OSCS添加量為0.25％時(shí)信號響應(yīng)微弱以至于難以與噪音分辨,所以確定該方法對OSCS的檢測限為0.5％的添加量。
　　2.SAX-HPLC檢測粗品肝素中OSCS
　　參照美國FDA文獻(xiàn)的方法,在粗品肝素中添加適量的OSCS美國藥典標(biāo)準(zhǔn)品確立OSCS的檢測限。兩種方法得到的結(jié)果與核磁共振的結(jié)果一致,添加0.25％OSCS美國藥典標(biāo)準(zhǔn)品的粗品肝素中的OSCS特征峰很難辨別;因此,SAX-HPLC檢測粗品肝

6、素中OSCS的檢測限為0.5％的添加量。美國FDA文獻(xiàn)建立的方法所耗費(fèi)的時(shí)間比中國藥典2010年版要短,更具有實(shí)際采用的價(jià)值。
　　3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測粗品肝素中的反芻基因
　　考察了2種引物和2種熒光定量PCR方法對于粗品肝素中反芻基因的擴(kuò)增情況。2組引物均會引起豬DNA與反芻動物DNA產(chǎn)生交叉反應(yīng),該交叉反應(yīng)對豬DNA和反芻DNA的鑒別不構(gòu)成嚴(yán)重障礙。對豬、反芻的DNA檢測限分別為1.16pg/μl、0.05pg/